[發明專利]一種辨別鯉魚三種肌肉細胞的組織學方法

有效

• 申請號: 201710865926.0
• 申請日: 2017-09-22
• 公開（公告）號: CN107831112B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 梁佳
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: G01N21/00
• 分類號: G01N21/00;G01N1/42;G01N1/30;G01N1/06
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種辨別鯉魚三種肌肉細胞的組織學方法，包括凍結、切片、前處理、ATPase反應、發色、光學顯微鏡觀察，其特征在于：

所述的凍結步驟為：將從鯉魚背部取的樣品塊用冷凍保護劑清洗后放在樣品臺上，滴加冰凍切片包埋劑，再將樣品與樣品臺放入裝有異戊烷的容器中，并將容器放入液氮中急速冷凍至凍結點即可；冷凍保護劑的濃度為2-3%，冷凍保護劑為海藻糖和糖苷，其重量比為1:0.6-0.8，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比為1:83-92；

所述的切片步驟為：將達到凍結點后的樣品在-20至-30℃下保持50-70min，然后切出厚度為9-11μm的切片，將收集切好的樣品移至載玻片上，室溫下干燥即得樣品切片；

所述的前處理步驟為：將裝有前處理溶液的前處理容器保持溫度恒定，然后將樣品切片放入前處理容器中處理，處理后倒出前處理溶液，再用清洗液清洗；

所述的ATPase反應步驟為：前處理切片中加入清洗液，然后放入18-22℃恒溫槽中至溫度恒定，再將清洗液完全倒出，立刻加入反應液反應，反應結束后將反應液倒出，立即加入蒸餾水清洗3-4次，再加入蒸餾水浸漬1-2min，重復浸漬6-8次，即得ATPase反應切片；

所述的發色步驟為：將ATPase反應切片用CaCl₂溶液浸泡后用蒸餾水清洗，浸漬；然后加入CoCl2溶液浸泡，結束后用蒸餾水清洗，浸漬；再用硫化銨溶液浸泡，倒出硫化銨溶液后，結束后用蒸餾水清洗，浸漬，即得發色切片；

所述的光學顯微鏡觀察步驟為：取出發色切片，吸取多余水分，蓋上蓋玻片，甘油封片后，利用光學顯微鏡進行觀察，即可辨別鯉魚三種肌肉細胞；

所述的前處理步驟中前處理溶液含有0.09-0.11M抑胰肽酶緩沖液和17-19mMCaCl₂，前處理溶液的pH為10.40-10.60；

所述的前處理步驟中清洗液的組成為：17-19mMCaCl₂、48-52mMKCl和0.09-0.11M2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液，清洗液的pH為9.35-9.45，清洗2-3次，每次清洗13-16min；

所述的ATPase反應步驟中反應液的組成為：17-19mMCaCl₂、48-52mMKCl、3.0-3.2mM ATP和0.09-0.11M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液，反應液的pH為9.35-9.45，反應液的溫度為18-22℃，反應時間為25-35min。

2.根據權利要求1所述的一種辨別鯉魚三種肌肉細胞的組織學方法，其特征在于：所述的前處理步驟中恒溫溫度為18-22℃，樣品切片恒溫處理20-30min。

3.根據權利要求1所述的一種辨別鯉魚三種肌肉細胞的組織學方法，其特征在于：所述的發色步驟中CaCl₂溶液濃度為0.8-1.1%，浸泡3-4min；CoCl₂溶液濃度為1.8-2.1%，浸泡3-4min；硫化銨溶液濃度為0.8-1.1%，浸泡50-70s。