[發明專利]一種運用電化學發光成像識別技術的生物標志物檢測方法

有效

• 申請號: 201710862223.2
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107764803B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 黃曦;廖玉輝;趙釗艷;譚青琴
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/53
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 羅丹

本發明公開一種運用電化學發光成像識別技術的生物標志物檢測方法，首先構建電化學發光放大探針，往提取樣品中加入所述電化學發光放大探針，使生物標志物與電化學發光信號放大探針連接，得到體系1；往體系1中加入捕捉探針，使生物標志物與捕捉探針連接，得到體系2；往體系2中加入鏈霉親和素磁珠，充分渦旋混勻后使生物標志物與鏈霉親和素磁珠連接，然后用磁分離器分離，用PBS 1X緩沖液沖洗；用超純水混勻步驟一所得產物，然后置于電化學發光成像系統中檢測發光信號。本發明優點在于：1)信號采集靈敏度高、形象化且可定量化統計分析；(2)樣品兼容性好；(3)操作簡單快速、無需進行樣品擴增；本發明檢測過程簡單，經過簡單的樣品提取過程即可進行生物標志物監測，耗時短，省去了擴增步驟，檢測快速。

技術領域

本發明屬于生物標志物檢測技術領域，特別涉及一種基于單分子電化學發光識別系統的生物標志物檢測方法及其應用。

背景技術

隨著生命科學技術的日新月異，越來越多的生物標志物在相關技術領域發揮著日益重要的作用。其中microRNA、端粒酶、CEA蛋白及相關編碼RNA等重大標志物已成為生命科學、醫學等學科中的明星分子。然而，這些分子標志物現有的檢測技術存在技術路線不統一、儀器設備兼容性差、技術體系間協作無法實現等缺點。因此，開發通用的、高靈敏度、兼容性好且儀器試劑可共用的多功能檢測平臺，對于現有生物標志物的檢測具有重要意義。

本發明以microRNA、端粒酶、CEA蛋白及相關編碼RNA等重大生物標志物為研究對象，以高效的電化學發光放大方法作為技術支撐，開發了新型的單分子電化學發光成像識別方法，實現了靈敏度高、操作簡單、快速且成本低廉的生物標志物檢測方法。本發明提出的基于聚合物電化學發光信號放大方法，能夠為單分子識別技術提供有力的技術支持，通過構建特異的生物標志物識別、捕捉及信號放大探針等體系，該系統能為研究者提供精確、客觀、系統的監測指標。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種運用電化學發光成像識別技術的生物標志物檢測方法。本發明以三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物為切入點，合成線性及樹狀的三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物分子，以此構建聚合物放大體系，為單分子電化學發光成像系統提供放大的電化學發光信號，最終實現單分子識別的目的。為了進一步提升線性三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物以及樹狀三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物合成的便捷性，發明人前期設計了自動化的三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物合成設備，通過循環單體合成步驟實現線性及樹狀聚合物分子的合成。本發明開發的電化學發光成像識別系統由電化學模塊、顯微成像及圖像采集系統組成：電化學發光模塊采用芯片模式，并裝配可拆卸印刷電以克服傳統電極易氧化及重現性差的問題；顯微成像系統采用高分辨率顯微鏡，并配合高精度步進位移臺及芯片固定支架，最終得到穩定的、完整的顯微圖像信息；圖像采集系統采用高靈敏度電荷耦合器件(CCD)作為核心部件，并配合溫度控制及增益調節模塊實現高效的圖像采集過程。在單分子電化學發光成像識別系統的基礎上，本發明同時針對microRNA、端粒酶、CEA蛋白分別設計特異的標志物識別、捕捉及信號放大探針等體系，最終達到生物標志物的高靈敏度檢測的目的。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種運用電化學發光成像識別技術的生物標志物檢測方法，其主要包括以下內容：

1、總體技術路線及流程

本發明旨在于構建單分子電化學發光成像識別系統，并最終實現基于microRNA、端粒酶及CEA蛋白的高靈敏度檢測方法。本發明的技術路線如圖1所示：

1.1本發明以三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物為切入點，合成線性及樹狀的三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物分子，以此構建聚合物放大體系，為單分子電化學發光成像系統提供放大的電化學發光信號，最終實現單分子識別的目的。為了進一步提升線性三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物以及樹狀三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物合成的便捷性，設計了自動化的三聯吡啶釕-賴氨酸聚合物合成設備，通過循環單體合成步驟實現線性及樹狀聚合物分子的合成。