[發(fā)明專利]一種基于熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴿新城疫病毒的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710861515.4
• 申請(qǐng)日: 2017-09-21
• 公開（公告）號(hào): CN108486279A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉存霞;黨安坤;孫圣福;胡峰;于可響;張?jiān)?/a>;蘭鄒然
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所;山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京國(guó)坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

本發(fā)明屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴿新城疫病毒的方法。本發(fā)明所述基于熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴿新城疫病毒的方法，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)鴿NDV VI型進(jìn)行特異性檢測(cè)，而雞新城疫強(qiáng)毒株和經(jīng)典的LaSota疫苗毒株檢測(cè)結(jié)果為陰性，為鴿NDV的臨床檢測(cè)提供了一種快速、準(zhǔn)確、高通量的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴿新城疫病毒VI型的方法。

背景技術(shù)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染引起的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病，其宿主范圍非常廣泛，可以感染雞、鴿、鵝、鵪鶉等多種禽類，是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展最重要的疫病之一。NDV的基因組結(jié)構(gòu)為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，其可編碼基質(zhì)蛋白、融合蛋白等6種結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明，F(xiàn)蛋白在NDV致病過程中具有重要作用，其中，根據(jù)F蛋白裂解區(qū)域112-117位氨基酸序列差異將NDV分為強(qiáng)毒株、中等毒力株和弱毒株。根據(jù)F基因47-420位核苷酸的遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)鴿NDV區(qū)別于其他基因型的NDV，單獨(dú)處于一個(gè)分支，并將其歸為基因VIb亞型。因此，鴿新城疫病毒被認(rèn)為是雞源NDV的一種變異株，但與經(jīng)典的雞源NDV相比，其在致病性上存在很大差異，它只引起鴿子發(fā)病，而對(duì)雞的致病力非常溫和。

雖然當(dāng)前養(yǎng)雞場(chǎng)新城疫得到了有效預(yù)防控制，但由于缺乏防控鴿新城疫的專用疫苗，鴿新城疫仍在一些養(yǎng)鴿場(chǎng)爆發(fā)流行，給養(yǎng)鴿業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，能否及時(shí)、準(zhǔn)確、快速進(jìn)行確診，對(duì)于鴿新城疫的有效控制具有重大意義。當(dāng)前新城疫的診斷方法主要包括病毒分離鑒定、血凝-血凝抑制試驗(yàn)等經(jīng)典方法和RT-PCR等分子診斷技術(shù)。但經(jīng)典的檢測(cè)方法則需耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，易耽誤臨床診斷；更重要的是，經(jīng)典的檢測(cè)方法雖然能檢測(cè)出NDV，但較難區(qū)分出雞源NDV和鴿源NDV，這對(duì)于新城疫的診斷及預(yù)防都會(huì)造成一定的影響。

熒光定量PCR技術(shù)(realtimefluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，熒光定量PCR在RT-PCR基礎(chǔ)上通過熒光染料及探針具有更高的靈敏性和特異性，并對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可直接對(duì)病料組織進(jìn)行快速、準(zhǔn)確診斷。本發(fā)明研究了基于熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴿新城疫病毒的方法，為實(shí)際生產(chǎn)中盡早防控鴿新城疫病癥提供一種新的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴿新城疫病毒的方法，所述方法能更為準(zhǔn)確的鑒定出鴿新城疫病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的一種基于熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)鴿新城疫病毒總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)鴿新城疫病毒株，設(shè)計(jì)用于進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增的引物和熒光探針，并利用現(xiàn)有技術(shù)提取病毒總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；

(2)質(zhì)粒構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板擴(kuò)增NDV F基因，并將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，PCR鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒并送樣測(cè)序，得到pMD18T-F質(zhì)粒；

(3)熒光定量PCR檢測(cè)：以構(gòu)建的pMD18T-F質(zhì)粒為模板，采用一步法RT-PCR反應(yīng)體系，以不同濃度的質(zhì)粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)樣品檢測(cè)：選取待檢測(cè)樣品，加PBS緩沖液處理并取上清，按照步驟(1)-(3)提取RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)樣品。