[發明專利]一種基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法

在審

• 申請號: 201710861515.4
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN108486279A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 劉存霞;黨安坤;孫圣福;胡峰;于可響;張月;蘭鄒然
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院家禽研究所;山東省動物疫病預防與控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

1.一種基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)鴿新城疫病毒總RNA提取與反轉錄：根據鴿新城疫病毒株，設計用于進行熒光定量擴增的引物和熒光探針，并利用現有技術提取病毒總RNA，并進行反轉錄；

(2)質粒構建：設計引物以反轉錄cDNA為模板擴增NDV F基因，并將所得PCR擴增產物與pMD18-T載體連接，并轉化至DH5α感受態細胞中，PCR鑒定陽性質粒并送樣測序，得到pMD18T-F質粒；

(3)熒光定量PCR檢測：以構建的pMD18T-F質粒為模板，采用一步法RT-PCR反應體系，以不同濃度的質粒為陽性標準品，繪制標準曲線；

(4)樣品檢測：選取待檢測樣品，加PBS緩沖液處理并取上清，按照步驟(1)-(3)提取RNA并進行實時熒光RT-PCR檢測，并結合標準曲線測定待測樣品。

2.根據權利要求1所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述用于進行熒光定量擴增的引物包括：

上游引物(pF1)：5'-CAGAGAGTAATGGCAAAC-3'；

下游引物(pR1)：5'-ACGGTTAGAGCGATATAG-3'。

3.根據權利要求1所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述熒光探針(probe)的序列為：5'FAM-TCGGACTAATCAACACATCTGCTCT-TEMRA3'。

4.根據權利要求1-3任一項所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述提取病毒總RNA的步驟包括：取接種鴿新城疫病毒的尿囊液0.2mL，加入1mL Trizol，使其充分混勻后靜置，并加入0.2mL氯仿，振蕩后室溫靜置，離心取上清水相，轉移至新的EP管中，加入等體積的預冷異丙醇，室溫靜置閉關離心棄上清，向沉淀中加入1mL 70％預冷的乙醇洗滌RNA沉淀，離心并室溫干燥，并加入14μL DEPC水RNA充分溶解，即得。

5.根據權利要求4所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述反轉錄步驟中，所述反轉錄體系包括：dNTPs 2.5mM、反轉錄酶M-MLV、5×反轉錄酶緩沖液，以及RNA抑制劑。

6.根據權利要求1-3任一項所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述擴增NDV F基因步驟中，所用引物包括：

上游引物(pF3)：5'-CAggATgggCTCCAgACCTT-3'；

下游引物(pR1)：5'-ACCTTCgTTCCTCATCTgTgTT-3'。

7.根據權利要求1-6任一項所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述RT-PCR反應體系包括：

2×OneStep RT-PCR BufferⅢ10μL；

TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.4μl；

Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μl；

模板2μL(50ng)；

Probe 0.3uL；

正鏈引物0.4μL；

負鏈引物0.4μL；

補加ddH2O至20μL。

8.根據權利要求7所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述熒光PCR測定步驟中，循環參數為：經95℃10s、60℃15s、95℃20s共40個循環分析熔解曲線。

9.根據權利要求7或8所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述PCR擴增反應的退火溫度為58℃。

10.權利要求1-9任一項所述基于熒光定量PCR技術檢測鴿新城疫病毒的方法在鴿新城疫病毒檢測領域中的應用。