[發明專利]血清中25?羥基維生素D2/D3雙流路平行液相色譜質譜聯用含量檢測方法

在審

• 申請號: 201710860420.0
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107478761A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 任彪;李長坤;李月琪;黃濤宏
• 申請（專利權）人: 島津企業管理（中國）有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 張祥明

技術領域

本發明涉及一種檢測方法，具體涉及一種血清中25-羥基維生素D₂/D₃雙流路平行液相色譜質譜聯用含量檢測方法。屬于分析檢測技術領域。

背景技術

維生素D是一類脂溶性激素，對人體的骨骼健康，鈣、磷的體內平衡調節起到重要作用，此外維生素D還有著廣泛的非骨骼效應，與心血管疾病、免疫疾病、糖尿病和腫瘤等疾病密切相關。維生素D的缺乏可導致骨骼發育受損，以及各類慢性疾病的發病風險增加，如類風濕性關節炎、軟骨化、冠心病、糖尿病和腫瘤等。人體維生素D的來源主要有兩個途徑，一是通過膳食途徑攝入的維生素D₂(酵母或真菌)和維生素D₃(魚、魚肝油或蛋黃)，二是機體經光照將皮膚中的7-脫氫膽甾醇轉化為維生素D₃。

維生素D在肝臟中可轉化為25-羥基維生素D(25-OHD)，從而被機體轉運或儲藏，因此體內25-OHD含量可有效反映人體維生素D的營養狀態。此外，25-OHD在體內穩定，半衰期長，其濃度水平與體內維生素D含量直接相關，因此25-OHD可作為一類主要的生物標志物用于體現機體維生素D水平。

目前，25-OHD的檢測方法有多種，包括免疫檢測、HPLC法和LC-MS/MS方法等。其中，LC-MS/MS法具有特異性強、準確度高、分析時間短等特點，被認為是評價機體維生素D營養狀況的“金標準”。但是，現有的常規LC-MS/MS方法檢測時間長，檢測設備使用成本較高。

發明內容

本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種血清中25-羥基維生素D₂/D₃含量檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

血清中25-羥基維生素D₂/D₃含量檢測方法，包括步驟：

(1)樣品前處理：向加入內標工作液的血清樣品中依次加入飽和硫酸鋅溶液和乙腈，震蕩，靜置，加入正己烷，震蕩，高速離心，取上層有機層，吹干，復溶配成甲醇溶液；

(2)利用液相色譜串聯質譜法進行分析檢測，其中，液相色譜采用第一平行液相和第二平行液相進行雙樣品交替分析，任一平行液相分析的同時另一平行液相洗平衡，任一平行液相完成數據采集時，另一平行液相立即開始采集數據，以實現連續數據采集，流動相包括A相和B相，A相為質量濃度0.1％的甲酸水溶液，B相為含質量濃度0.1％的甲酸和2mmol/L乙酸銨的甲醇溶液；分析和洗平衡的梯度洗脫時間程序分別如表1和表2所示。

表1.分析的梯度洗脫時間程序

表2.洗平衡的梯度洗脫時間程序

優選的，步驟(1)的具體方法是：取100μL血清樣品于1.5mL離心管中，加入10μL內標工作液，充分混勻；再加入飽和硫酸鋅溶液100μL：加入200μL乙腈；劇烈震蕩30秒，室溫靜置15分鐘；加入1mL正己烷，劇烈震蕩30秒，14000g以上離心5分鐘；取最上層有機層600μL，室溫下氮氣吹干，加入75％甲醇溶液200μL，充分混勻30秒。

進一步優選的，所述內標工作液的配制方法如下：用甲醇配制濃度為1000μg/mL的D6-25-OHD₂和D6-25-OHD₃的混合內標儲備液，再用甲醇稀釋為濃度為25ng/mL的內標工作液。

優選的，步驟(2)中的液相色譜采用島津Nexera MX系統。

優選的，步驟(2)中的質譜采用三重四極桿質譜儀。

優選的，步驟(2)中的液相色譜條件如下：

色譜柱：Shim-pack XR-C8(2.0mm I.D.×50mm L.，2.2μm)

流速：0.4mL/min

柱溫：25℃

進樣量：20μL

自動進樣器溫度：4℃

閥切換時間：0.15min.。

優選的，步驟(2)中的質譜條件如下：

表3.MRM參數

本發明的有益效果：