[發(fā)明專利]一種針對電子煙氣溶膠水提物的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710860293.4
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107746872A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管瑩;米其利;鞏效偉;洪鎏;朱洲海;徐玉瓊;陸舍銘;高茜;李雪梅;夭建華
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12R1/42
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)53108
• 代理人: 謝嘉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于煙草及煙草制品的安全性生物學(xué)評價(jià)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種針對電子煙煙霧的氣溶膠水提物進(jìn)行的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)今，化學(xué)物質(zhì)及其污染物對人體的潛在危害越來越受到社會的普遍關(guān)注與重視。B.N.Ames等于1975年建立并不斷發(fā)展完善的沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))被世界各國及組織廣為采用，是目前國際公認(rèn)的檢測新藥、食品添加劑,食品包裝材料及化妝品等的致突變性、致癌性的首選試驗(yàn)方法。國際煙草科學(xué)研究合作中心CORESTA組織于2002年成立了卷煙煙氣體外毒理測試工作組，經(jīng)過工作組大量的文獻(xiàn)調(diào)研及研究工作，該工作組推薦采用細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))對卷煙煙氣冷凝物潛在的致突變性進(jìn)行檢測。該檢測方法目前已經(jīng)被國內(nèi)外煙草公司廣泛采用。

煙草監(jiān)管立法的日趨嚴(yán)格以及吸煙與健康研究的深入，導(dǎo)致了煙草公司尋求風(fēng)險(xiǎn)更低、無環(huán)境煙氣的新型煙草制品，電子煙制品避免了傳統(tǒng)卷煙制品燃燒所產(chǎn)生的復(fù)雜混合物所帶來的危害，現(xiàn)階段已成為國外煙草公司從傳統(tǒng)卷煙制品轉(zhuǎn)向的新方向之一。電子煙制品其使用過程中通過電加熱或者電子霧化方式使由煙堿、香味物質(zhì)等組成的液體轉(zhuǎn)化為類似于卷煙煙霧的混合物，再將汽化丙三醇/尼古丁等混合“煙霧”傳送至消費(fèi)者，使人吸入劑量不等的尼古丁而獲得類似于抽吸傳統(tǒng)卷煙的生理感受。使用過程中不產(chǎn)生煙氣，其使用方式顯著有別于傳統(tǒng)卷煙，檢測對象的改變導(dǎo)致樣品前處理方法、檢測劑量也有所不同，用于檢測傳統(tǒng)卷煙致突變性的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))已不能滿足電子煙制品致突變性檢測的需要，且目前國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)及煙草公司尚未制定電子煙氣溶膠水提物細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

電子煙制品通過電加熱或者電子霧化方式使由煙堿、香味物質(zhì)等組成的煙液轉(zhuǎn)化為類似于卷煙煙霧的混合物，再將霧化后的丙三醇/尼古丁等混合“煙霧”傳送至消費(fèi)者，使人吸入劑量不等的尼古丁而獲得類似于抽吸傳統(tǒng)卷煙的生理感受。電子煙煙液經(jīng)霧化后進(jìn)入口腔和呼吸道，經(jīng)由唾液及呼吸道粘液遷移作用于機(jī)體。而現(xiàn)有技術(shù)通常是直接對電子煙液本身進(jìn)行分析測試，未考慮其抽吸時(shí)的形態(tài)、遷移等過程，導(dǎo)致分析測試的結(jié)果不能準(zhǔn)確反應(yīng)電子煙煙霧真實(shí)的遺傳毒性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對電子煙煙霧的氣溶膠水提物進(jìn)行的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)方法，以滿足電子煙制品致突變性檢測的需要，增強(qiáng)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)而更為有效地評價(jià)電子煙制品的安全性。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。

一種針對電子煙氣溶膠水提物的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)，具體為以下步驟：

(1)樣品前處理：

采用直線型吸煙機(jī)，在抽吸容量為55.0ml，抽吸持續(xù)時(shí)間3s，抽吸頻率30s的條件下，連續(xù)抽吸100口電子煙，用裝有FM細(xì)胞培養(yǎng)基的捕集瓶捕集煙霧，捕集濃度為20口/mL，捕集液用0.22μm無菌過濾器過濾除菌，得到電子煙煙霧的氣溶膠水提物作為待測液，-80℃保存待用；

(2)受試菌的培養(yǎng)：

將TA98和TA100鼠傷寒沙門氏工程菌分別加入到裝有培養(yǎng)基的無菌三角瓶中，置于37℃條件下，靜置培養(yǎng)16h或100次/min振蕩培養(yǎng)10h；

(3)受試菌濃度的確定：

用紫外分光光度計(jì)分別測定培養(yǎng)所得TA98和TA100鼠傷寒沙門氏工程菌在600nm下的OD值，然后用培養(yǎng)基稀釋菌液至其OD₆₀₀值為0.5；

(4)S9混合液的配制：

將1.65mol/L的氯化鉀溶液和0.4mol/L的氯化鎂溶液按照1:1的體積比混合后配制成氯化鉀-氯化鎂溶液；取磷酸緩沖液、氯化鉀-氯化鎂溶液、0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸鈉鹽緩沖液和0.025mol/L的輔酶-Ⅱ溶液，按照30:2:5:8的體積比混合，用0.22μm無菌過濾器過濾除菌后，與S9代謝活化液按照9:1的體積比混合，配制成S9混合液備用；

(5)受試物的分組

將受試物分為四組：自發(fā)回變組、溶劑對照組、陽性對照組和樣品測試組；其中，樣品測試組按表1所示的不同劑量將待測液加入培養(yǎng)中；自發(fā)回變組、溶劑對照組和陽性對照組則按表2所示的不同劑量將待測液加入培養(yǎng)中；將自發(fā)回變組、溶劑對照組、陽性對照組、樣品測試組樣品分別按表3所示的4個(gè)檢測體系加樣；

表1Ames細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)樣品測試組加樣表