[發明專利]一種針對電子煙氣溶膠水提物的細菌回復突變試驗

在審

• 申請號: 201710860293.4
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107746872A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 管瑩;米其利;鞏效偉;洪鎏;朱洲海;徐玉瓊;陸舍銘;高茜;李雪梅;夭建華
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12R1/42
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙)53108
• 代理人: 謝嘉

1.一種針對電子煙氣溶膠水提物的細菌回復突變試驗，具體為以下步驟：

(1)樣品前處理：

采用直線型吸煙機，在抽吸容量為55.0ml，抽吸持續時間3s，抽吸頻率30s的條件下，連續抽吸100口電子煙，用裝有FM細胞培養基的捕集瓶捕集煙霧，捕集濃度為20口/mL，捕集液用0.22μm無菌過濾器過濾除菌，得到電子煙煙霧的氣溶膠水提物作為待測液，-80℃保存待用；

(2)受試菌的培養：

將TA98和TA100鼠傷寒沙門氏工程菌分別加入到裝有培養基的無菌三角瓶中，置于37℃條件下，靜置培養16h或100次/min振蕩培養10h；

(3)受試菌濃度的確定：

用紫外分光光度計分別測定培養所得TA98和TA100鼠傷寒沙門氏工程菌在600nm下的OD值，然后用培養基稀釋菌液至其OD₆₀₀值為0.5；

(4)S9混合液的配制：

將1.65mol/L的氯化鉀溶液和0.4mol/L的氯化鎂溶液按照1:1的體積比混合后配制成氯化鉀-氯化鎂溶液；取磷酸緩沖液、氯化鉀-氯化鎂溶液、0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸鈉鹽緩沖液和0.025mol/L的輔酶-Ⅱ溶液，按照30:2:5:8的體積比混合，用0.22μm無菌過濾器過濾除菌后，與S9代謝活化液按照9:1的體積比混合，配制成S9混合液備用；

(5)受試物的分組

將受試物分為四組：自發回變組、溶劑對照組、陽性對照組和樣品測試組；其中，樣品測試組按表1所示的不同劑量將待測液加入培養中；自發回變組、溶劑對照組和陽性對照組則按表2所示的不同劑量將待測液加入培養中；將自發回變組、溶劑對照組、陽性對照組、樣品測試組樣品分別按表3所示的4個檢測體系加樣；

表1 Ames細菌回復突變試驗樣品測試組加樣表

表2 Ames細菌回復突變試驗自發回變組、溶劑對照組、陽性對照組加樣表

表3 Ames細菌回復突變試驗4個檢測體系加樣表

(6)受試物的培養

將各組受試物分別加入到2.0mL，40℃水浴保溫的0.6％(W/V)瓊脂頂層培養基中，混勻后迅速倒入1.8％(W/V)瓊脂底層培養基中，轉動平皿使頂層培養基均勻分布在底層上，平放固化，每個劑量設3個復皿，置于37℃、5％CO₂培養箱中培養48h，觀察結果；

(7)結果判定

計算培養長出的回變菌落數，在背景生長良好的條件下，樣品測試組誘發的回變菌落數等于或大于自發回變組菌落數的2倍以上，并有劑量效應關系，即認為樣品測試組試驗結果為陽性。