[發(fā)明專利]一種針對電子煙氣溶膠水提物的細(xì)菌回復(fù)突變試驗

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710860293.4
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107746872A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 管瑩;米其利;鞏效偉;洪鎏;朱洲海;徐玉瓊;陸舍銘;高茜;李雪梅;夭建華
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12R1/42
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)53108
• 代理人: 謝嘉

1.一種針對電子煙氣溶膠水提物的細(xì)菌回復(fù)突變試驗，具體為以下步驟：

(1)樣品前處理：

采用直線型吸煙機(jī)，在抽吸容量為55.0ml，抽吸持續(xù)時間3s，抽吸頻率30s的條件下，連續(xù)抽吸100口電子煙，用裝有FM細(xì)胞培養(yǎng)基的捕集瓶捕集煙霧，捕集濃度為20口/mL，捕集液用0.22μm無菌過濾器過濾除菌，得到電子煙煙霧的氣溶膠水提物作為待測液，-80℃保存待用；

(2)受試菌的培養(yǎng)：

將TA98和TA100鼠傷寒沙門氏工程菌分別加入到裝有培養(yǎng)基的無菌三角瓶中，置于37℃條件下，靜置培養(yǎng)16h或100次/min振蕩培養(yǎng)10h；

(3)受試菌濃度的確定：

用紫外分光光度計分別測定培養(yǎng)所得TA98和TA100鼠傷寒沙門氏工程菌在600nm下的OD值，然后用培養(yǎng)基稀釋菌液至其OD₆₀₀值為0.5；

(4)S9混合液的配制：

將1.65mol/L的氯化鉀溶液和0.4mol/L的氯化鎂溶液按照1:1的體積比混合后配制成氯化鉀-氯化鎂溶液；取磷酸緩沖液、氯化鉀-氯化鎂溶液、0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸鈉鹽緩沖液和0.025mol/L的輔酶-Ⅱ溶液，按照30:2:5:8的體積比混合，用0.22μm無菌過濾器過濾除菌后，與S9代謝活化液按照9:1的體積比混合，配制成S9混合液備用；

(5)受試物的分組

將受試物分為四組：自發(fā)回變組、溶劑對照組、陽性對照組和樣品測試組；其中，樣品測試組按表1所示的不同劑量將待測液加入培養(yǎng)中；自發(fā)回變組、溶劑對照組和陽性對照組則按表2所示的不同劑量將待測液加入培養(yǎng)中；將自發(fā)回變組、溶劑對照組、陽性對照組、樣品測試組樣品分別按表3所示的4個檢測體系加樣；

表1 Ames細(xì)菌回復(fù)突變試驗樣品測試組加樣表

表2 Ames細(xì)菌回復(fù)突變試驗自發(fā)回變組、溶劑對照組、陽性對照組加樣表

表3 Ames細(xì)菌回復(fù)突變試驗4個檢測體系加樣表

(6)受試物的培養(yǎng)

將各組受試物分別加入到2.0mL，40℃水浴保溫的0.6％(W/V)瓊脂頂層培養(yǎng)基中，混勻后迅速倒入1.8％(W/V)瓊脂底層培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)動平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，每個劑量設(shè)3個復(fù)皿，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果；

(7)結(jié)果判定

計算培養(yǎng)長出的回變菌落數(shù)，在背景生長良好的條件下，樣品測試組誘發(fā)的回變菌落數(shù)等于或大于自發(fā)回變組菌落數(shù)的2倍以上，并有劑量效應(yīng)關(guān)系，即認(rèn)為樣品測試組試驗結(jié)果為陽性。