[發(fā)明專利]檢測(cè)電子煙氣溶膠水提物對(duì)細(xì)胞超氧化物歧化酶活性影響的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710859586.0
• 申請(qǐng)日: 2017-09-21
• 公開（公告）號(hào): CN107807233A
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管瑩;徐玉瓊;陸舍銘;朱東來(lái);張霞;朱洲海;米其利;高茜;夭建華;李雪梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N33/50
• 分類號(hào): G01N33/50;G01N21/31
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)53108
• 代理人: 謝嘉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于煙草及煙草制品的安全性生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種檢測(cè)電子煙氣溶膠水提物對(duì)細(xì)胞超氧化物歧化酶活性影響的方法。

背景技術(shù)

隨著人們對(duì)健康的關(guān)注越來(lái)越高，對(duì)煙草產(chǎn)品提出了更高的要求，不但要有較好的口感，而且要盡可能的減少人體的不良感受。電子煙制品避免了傳統(tǒng)卷煙制品燃燒所產(chǎn)生的復(fù)雜混合物所帶來(lái)的危害，現(xiàn)階段已成為國(guó)外煙草公司從傳統(tǒng)卷煙制品轉(zhuǎn)向的新方向之一。電子煙制品其使用過(guò)程中通過(guò)電加熱或者電子霧化方式使由煙堿、香味物質(zhì)等組成的液體轉(zhuǎn)化為類似于卷煙煙霧的混合物，再將霧化后的丙三醇/尼古丁等混合“煙霧”傳送至消費(fèi)者，使人吸入劑量不等的尼古丁而獲得類似于抽吸傳統(tǒng)卷煙的生理感受。電子煙研發(fā)人員在煙液產(chǎn)品配方設(shè)計(jì)初期，將不同組份按照不同比例組合調(diào)配，形成具有不同風(fēng)格的初選配方，再結(jié)合化學(xué)評(píng)價(jià)和感官評(píng)價(jià)對(duì)配方進(jìn)行不斷篩選調(diào)整，形成最終的產(chǎn)品配方。但初選配方數(shù)量眾多，全部進(jìn)行感官評(píng)價(jià)耗時(shí)耗力，且感官評(píng)價(jià)側(cè)重于對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)格口感進(jìn)行篩選，如何利用生物學(xué)測(cè)試技術(shù)對(duì)產(chǎn)品初選配方進(jìn)篩選，以獲得降低人體不良感受的產(chǎn)品配方，目前尚屬探索階段，并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法。

人的機(jī)體在遭受各種不利刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生過(guò)多，當(dāng)氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織的氧化性損傷。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase簡(jiǎn)稱SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，它可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫。盡管過(guò)氧化氫仍是對(duì)機(jī)體有害的活性氧自由基，但體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶(CAT)會(huì)將其分解為完全無(wú)害的水，因此，超氧化物歧化酶活性的高低直接影響到自由基的有效清除，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，可用于產(chǎn)品初選配方的進(jìn)一步篩選，以獲得降低人體不良感受的產(chǎn)品配方。

同時(shí)，電子煙煙液經(jīng)霧化后進(jìn)入口腔和呼吸道，經(jīng)由唾液及呼吸道粘液遷移作用于機(jī)體。而現(xiàn)有技術(shù)通常是直接對(duì)電子煙液本身進(jìn)行分析測(cè)試，未考慮其抽吸時(shí)的形態(tài)、遷移等過(guò)程，導(dǎo)致分析測(cè)試的結(jié)果出現(xiàn)誤差，不能準(zhǔn)確反應(yīng)電子煙煙液對(duì)細(xì)胞超氧化物歧化酶酶活力的真實(shí)影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)電子煙氣溶膠水提物對(duì)細(xì)胞超氧化物歧化酶活性影響的方法，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)電子煙制品對(duì)細(xì)胞的氧化性損傷影響提供技術(shù)支持。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。

一種檢測(cè)電子煙氣溶膠水提物對(duì)細(xì)胞超氧化物歧化酶活性影響的方法，具體為以下步驟：

(1)樣品前處理：

采用直線型吸煙機(jī)，在抽吸容量為55.0ml，持續(xù)時(shí)間3s，抽吸頻率30s的條件下，連續(xù)抽吸100口電子煙，用裝有FM細(xì)胞培養(yǎng)基的捕集瓶捕集電子煙煙霧，捕集濃度為20口/mL，捕集液用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌，得到電子煙煙霧的氣溶膠水提物作為待測(cè)液，-80℃保存待用；

(2)單細(xì)胞懸浮液的制備：

人肺成纖維細(xì)胞HPF復(fù)蘇后，接種到25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入10mL FM細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的匯合和形態(tài)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至70％～90％的匯合率時(shí)，移除培養(yǎng)瓶中的FM細(xì)胞培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液洗兩次，棄洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液?jiǎn)螌臃跤?～2min，用FM細(xì)胞培養(yǎng)基懸起，形成單細(xì)胞懸浮液；

(3)單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度計(jì)算：

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對(duì)所得單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度進(jìn)行計(jì)算，得到每毫升單細(xì)胞懸浮液的活細(xì)胞數(shù)；

(4)細(xì)胞接種：

將計(jì)數(shù)后的單細(xì)胞懸浮液用FM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至2.0×10⁵個(gè)/mL，接種到100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿6ml，然后將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；

(5)受試物暴露

取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，按照表1將不同劑量的待測(cè)液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

表1 細(xì)胞超氧化物歧化酶活性檢測(cè)加樣表

(6)收集細(xì)胞：