[發明專利]檢測電子煙氣溶膠水提物對細胞超氧化物歧化酶活性影響的方法

在審

• 申請號: 201710859586.0
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107807233A
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 管瑩;徐玉瓊;陸舍銘;朱東來;張霞;朱洲海;米其利;高茜;夭建華;李雪梅
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N21/31
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙)53108
• 代理人: 謝嘉

1.一種檢測電子煙氣溶膠水提物對細胞超氧化物歧化酶活性影響的方法，具體為以下步驟：

(1)樣品前處理：

采用直線型吸煙機，在抽吸容量為55.0ml，持續時間3s，抽吸頻率30s的條件下，連續抽吸100口電子煙，用裝有FM細胞培養基的捕集瓶捕集電子煙煙霧，捕集濃度為20口/mL，捕集液用0.22μm無菌過濾器過濾除菌，得到電子煙煙霧的氣溶膠水提物作為待測液，-80℃保存待用；

(2)單細胞懸浮液的制備：

人肺成纖維細胞HPF復蘇后，接種到25cm²細胞培養瓶中,加入10mL FM細胞培養基，置于37℃、5％CO₂培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至70％～90％的匯合率時，移除培養瓶中的FM細胞培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，棄洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液單層孵育1～2min，用FM細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；

(3)單細胞懸浮液的細胞濃度計算：

用血球計數板計數法對所得單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，得到每毫升單細胞懸浮液的活細胞數；

(4)細胞接種：

將計數后的單細胞懸浮液用FM細胞培養基稀釋至2.0×10⁵個/mL，接種到100mm細胞培養皿中，每皿6ml，然后將細胞培養皿置于37℃、5％CO₂培養箱內培養24h；

(5)受試物暴露

取出細胞培養皿，去除細胞培養液，按照表1將不同劑量的待測液加入細胞培養皿中，每個劑量設3個復孔，置于37℃，5％CO₂培養箱中培養24h；

表1細胞超氧化物歧化酶活性檢測加樣表

(6)收集細胞：

移除細胞培養皿中的培養基，培養皿中的細胞用PBS磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入質量濃度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的細胞用HPF細胞培養基懸起，分別收集到15ml離心管中，1000rpm，4℃條件下離心10min，去上清；

(7)細胞裂解

在每支離心管中加入100μL細胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃條件下離心10min，取上清液待測；

(8)樣品測定：在不同的離心管內加入20μL待測上清液作為檢測樣品組，空白對照1加入20μL檢測緩沖液，空白對照2加入40μL檢測緩沖液；檢測樣品組和空白對照組還分別加入180μL氮藍四唑顯色工作液，37℃下孵育30分鐘，于560nm測定吸光度；

(9)超氧化物歧化酶酶活力計算：

a.根據步驟(8)所得吸光度值計算抑制百分率，抑制百分率＝(A空白對照1－A樣品)/(A空白對照1－A空白對照2)×100％；

b.SOD酶活力的計算：待測樣品中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units。