[發明專利]用于篩選長牡蠣高糖原含量親貝的方法及其相關引物對

有效

• 申請號: 201710855485.6
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107354234B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 張國范;李莉;孟杰;宋凱;李春燕;劉圣;史瑞輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種用檢測SNP標記位點的引物篩選高糖原含量長牡蠣親貝的方法，其特征在于：

所述SNP標記位點位于序列SEQ ID No.1第501bp處，該位點存在A和G兩個堿基形式，在苗種繁育前對長牡蠣親貝進行該SNP標記位點基因型鑒定，不同基因型糖原含量的順序為GGAGAA，通過篩選該位點GG基因型的長牡蠣親貝，提高后代群體的糖原含量;

包括步驟如下：

（1）所述長牡蠣親貝基因組DNA的提取，具體為提取長牡蠣親貝基因組DNA，使用滅菌水或TE緩沖液稀釋到10-20ng/μL;

（2）取上述長牡蠣親貝基因組DNA為模板，利用引物配制反應體系：

具體反應體系為：基因組DNA 1μL，通用PCR mix 5μL，上游引物F和下游引物R各0.2μL，滅菌雙蒸水3.6μL；

所述上游引物F為：5’-TCCGAACTTGGAATCCTCTC-3’，

所述下游引物R為：5’-GCAAATGTTAAGGTGGCTCA-3’；

(3）PCR擴增的反應程序為：

（4）SnaPshot 模板制備： 在15μL PCR產物中加入5U SAP和2U ExoI震蕩混勻37℃保溫1小時，然后75℃保溫15 min以滅活SAP和ExoI酶;

（5）SnaPshot PCR擴增及純化：以PCR產物作為SnaPshot PCR的模板，SnaPshot PCR的特異引物序列為：

5’- TTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGTAAACCACACACGG-3’

產物純化：在10μL上述SnaPshot PCR產物中加入1 U SAP，震蕩混勻，37℃保溫1 小時，75℃保溫15 min以滅活酶，4℃保存24小時或-20℃長期保存;

（6）毛細管電泳

1）電泳樣品制備：首先將SnaPshot 產物稀釋 20 倍：

試劑范圍為：10μL總體積中包含Hi-Di Formamid 9.25μL，GS-120LIZ 0.25μL，SnaPshot產物0.5μL;

95℃變性5 min，后迅速冰冷 4 min;

2）毛細管電泳：使用3730XLDNA Analyzer對制備好的樣品進行毛細管電泳并搜集信號;環境條件：實驗室溫度：18-25 ℃；毛細管長度：50cm；加熱爐溫度：60℃；運行電壓：15kV,結果使用 GeneMapper V4.0 對實驗結果進行分析,判斷不同基因型。