[發明專利]多微固態發酵中產乙醇和產乳酸關鍵微生物的定量分析方法

有效

• 申請號: 201710855043.1
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107523625B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 楊帆;晏培;汪地強;方芳;陳堅;王莉
• 申請（專利權）人: 貴州茅臺酒股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/865;C12R1/645;C12R1/225;C12R1/01
• 代理公司: 北京市萬慧達律師事務所 11111
• 代理人: 謝敏楠;梁順珍

本發明涉及白酒釀造技術領域，具體涉及多微固態發酵中產乙醇和產乳酸關鍵微生物的定量分析方法。本發明采用特異性的引物對釀酒酵母的HIS3基因，粟酒裂殖酵母的AHD1基因，乳酸菌的16SrRNA片段進行定量PCR分析，以分析大曲和酒醅中釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的變化趨勢，用來預測酒精產量。本發明的方法具有檢測速度快，靈敏度高，準確性好，特異性好，免培養優點。

技術領域

本發明屬于釀酒技術領域，具體涉及白酒生產企業中的多微固態發酵中產乙醇和產乳酸關鍵微生物的定量分析方法。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)是醬香型白酒生產過程中主要的兩種產酒酵母，乳酸菌(包括乳球菌屬、乳桿菌屬、戊糖片球菌屬和魏斯式屬)是醬香型白酒生產中的一類主要產乳酸微生物，這些微生物存在于白酒生產的空氣、涼堂、大曲中，并且隨著酒醅的攤涼、拌曲和堆積發酵，富集在酒醅中。因此，酒醅中釀酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌數量的多少，在醬香型白酒的風味形成及產量穩定上起著重要作用。

目前，對酒醅中釀酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌數量的檢測方法是平板培養法。該方法雖然簡單、經濟，但勞動強度大、傳統培養生長緩慢(48小時以上)，而且有大部分乳酸菌很難用傳統方法培養。因此建立快速檢測酒醅中釀酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌數量的檢測方法勢在必行。熒光定量PCR技術具有快速、高靈敏性、特異性和精確性的特點。目前該技術已廣泛應用于食源性微生物檢測領域。然而，迄今國內還未見于利用熒光定量PCR方法檢測酒醅中釀酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌的報道。

發明內容

本發明的目的在于，在白酒生產工藝中，解決上述技術中存在的問題，快速、精確、特異性地檢測酒醅中的釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌。

本發明的目的通過以下技術手段實現：

一方面，本發明提供了一種多微固態發酵中產乙醇和產乳酸關鍵微生物的定量分析方法。

所述的多微固態發酵具體指的是酒醅發酵；所述產乙醇的關鍵微生物為釀酒酵母、粟酒裂殖酵母；所述的產乳酸關鍵微生物為乳酸菌。

該方法利用釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌保守性DNA序列(特異性片段)設計引物；然后使用該引物對待測基因組DNA進行熒光定量PCR擴增和檢測。該方法具有快速、高靈敏性、特異性和精確性的特點。

其中，所述的釀酒酵母的特異性片段為HIS3；

所述粟酒裂殖酵母的特異性片段為ADH1；

所述乳酸菌特異性片段為16SrRNA。

現有技術中釀酒酵母和粟酒裂殖酵母常用于定量PCR的保守序列有26SrRNAD1、D2區、18SrRNA基因、5SrRNA基因、ITS、GAP基因，以及乳酸菌16SrRNA，然而，經發明人實驗發現，對于酒醅和大曲中的釀酒酵母和粟酒裂殖酵母，這些現有研究中的保守位點都不太適于用于定量這三種菌的定量分析。

經發明人多次摸索實驗，發現釀酒酵母HIS3基因和粟酒裂殖酵母的ADH1以及乳酸菌16SrRNA基因更加適合于酒醅和大曲的實時定量。

作為優選的實施方式，定量PCR時，采用的引物對如下：

擴增釀酒酵母的引物對如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

擴增粟酒裂殖酵母的引物對如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

擴增乳酸菌的引物對如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本發明的設計的引物擴增穩定，擴增結果清晰，重復性好，靈敏度高，穩定性好，特異性好。