[發明專利]多微固態發酵中產乙醇和產乳酸關鍵微生物的定量分析方法

有效

• 申請號: 201710855043.1
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107523625B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 楊帆;晏培;汪地強;方芳;陳堅;王莉
• 申請（專利權）人: 貴州茅臺酒股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/865;C12R1/645;C12R1/225;C12R1/01
• 代理公司: 北京市萬慧達律師事務所 11111
• 代理人: 謝敏楠;梁順珍

1.多微固態發酵中產乙醇和產乳酸關鍵微生物的定量分析方法，其特征在于：以釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的DNA為模板，對釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特異性片段進行定量PCR分析；

所述的釀酒酵母特異性片段為HIS3；

所述粟酒裂殖酵母特異性片段為ADH1；

所述乳酸菌特異性片段為16SrRNA。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，定量PCR分析時，

擴增釀酒酵母的引物對如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

擴增粟酒裂殖酵母的引物對如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

擴增乳酸菌的引物對如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，釀酒酵母的擴增特異性片段HIS3的序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，粟酒裂殖酵母的擴增特異性片段ADH1的序列如SEQ ID NO.8所示。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，擴增釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸菌可以在同一反應體系內進行多重定量PCR，也可以在不同的體系中進行定量PCR。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，多微固態發酵為酒醅和大曲發酵。

7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，具體包含以下步驟：

(1)、提取基因組DNA：利用核酸提取儀震蕩破碎細胞，結合膜過濾純化的方法提取酒醅中微生物總基因組DNA；

(2)、定量PCR擴增：采用釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特異性引物，以酒醅微生物總基因組DNA為模板，對釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特異性片段進行特異性擴增；

(3)、定量分析：通過待測樣品的CT值對酒醅中釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌進行定量分析。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，擴增時，定量PCR反應程序為：95℃預變性30s，進入40個循環，95℃5s，55℃30s，溶解曲線：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1個循環。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，采用絕對定量PCR，所述的絕對定量PCR還包括標準曲線的制備。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，標準曲線的制備方法為：分別對釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸菌的特異性片段進行PCR擴增，得到特異性目的片段，將目的片段與質粒載體連接，獲得重組質粒，再將質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，挑選陽性克隆轉化子，提取得到高濃度質粒，將此質粒做10倍比稀釋，作為熒光定量PCR的標準樣品，從而進行熒光定量PCR獲得標準曲線。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，熒光定量PCR的反應程序為：95℃預變性30s，進入40個循環，95℃5s，55℃30s，溶解曲線：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1個循環。

12.一種多微固態發酵中產乙醇和產乳酸關鍵微生物的定量檢測引物，其特征在于，含有以下引物對：

如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的擴增釀酒酵母特異性片段的引物對；

如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的擴增粟酒裂殖酵母特異性片段的引物；

如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的擴增乳酸菌特異性片段的引物。

13.根據權利要求12所述的引物對，其特征在于，所述的釀酒酵母特異性片段為HIS3。