[發明專利]一種甘薯種薯復合病毒病（SPVD）病原的檢測方法

有效

• 申請號: 201710855039.5
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107385117B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 張道微;董芳;張超凡;黃艷嵐;周虹;張亞
• 申請（專利權）人: 湖南省作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11
• 代理公司: 北京德恒律治知識產權代理有限公司 11409
• 代理人: 章社杲;盧軍峰

本發明提供了一種甘薯種薯復合病毒病(SPVD)病原的檢測方法，包括：提取甘薯種薯RNA；將RNA反轉錄成cDNA；以cDNA為模板，用設計引物進行PCR的第一輪擴增，并且用瓊脂糖凝膠電泳對第一輪擴增產物進行第一輪檢測，其中，設計引物包括外引物和內引物；用瓊脂糖凝膠電泳分離第一輪擴增產物，并且回收目的DNA；以及以回收的目的DNA為模板，用內引物進行PCR的第二輪擴增，并且用瓊脂糖凝膠電泳對第二輪擴增產物進行第二輪檢測。該方法有效縮短了檢測時間、提高了檢測的準確性，適宜甘薯種薯抽樣檢測等實際生產過程。

技術領域

本發明涉及農作物病蟲害檢測技術領域，具體而言，涉及一種甘薯種薯復合病毒病(SPVD)病原的檢測方法。

背景技術

甘薯復合病毒病(Sweet potato virus diseases，SPVD)是由甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)和甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potatofeathery mottle virus，SPFMV)協生共侵染甘薯引起的病毒病害。協同侵染過程中，SPCSV充當激發病毒，介導兩者之間的協生作用，為SPFMV在植物體內的復制和運輸提供了便利，使SPFMV的致病性顯著增強，癥狀也會更加明顯。協同作用會促使病毒在植物中運動和積累，影響貯藏根產量，加重病毒病癥狀，從而造成甘薯減產、品質受損，嚴重時導致絕收。

目前，SPVD對甘薯的危害最為廣泛，易通過煙粉虱等傳播媒介迅速擴散，并且物流業的發展進一步加劇了其跨區傳播速度。甘薯一旦感染復合病毒病，除了脫毒繁殖外，目前尚無其他直接有效的防治方式，因而甘薯脫毒良種繁育和對良種繁育質量的檢測是防控甘薯復合病毒病通過物流迅速傳播的主要措施。國內外在甘薯脫毒種薯繁殖已經取得相當多的成效，然而目前對脫毒效果檢測和種薯的質量把控有待加強。由于表型鑒定、生理指標檢測等方法所需時間較長，在實際生產應用上受較大限制，主流的甘薯復合病毒病快速檢測方法主要以酶聯免疫檢測法和熒光定量PCR檢測法為主，存在檢測設備要求高、檢測成本偏高、出現假陽性和假陰性等問題，不易為實際生產過程接受。

發明內容

為了解決現有技術中存在的技術問題，本發明提供了一種甘薯種薯復合病毒病(SPVD)病原的檢測方法，包括：

提取甘薯種薯RNA；

將RNA反轉錄成cDNA；

以cDNA為模板，用設計引物進行PCR的第一輪擴增，并且用瓊脂糖凝膠電泳對第一輪擴增產物進行第一輪檢測，其中，所述設計引物包括外引物和內引物；

用瓊脂糖凝膠電泳分離第一輪擴增產物，并且回收目的DNA；以及

以回收的目的DNA為模板，用所述內引物進行PCR的第二輪擴增，并且用瓊脂糖凝膠電泳對第二輪擴增產物進行第二輪檢測。

在上述檢測方法中，所述甘薯種薯復合病毒病(SPVD)病原包括甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)和甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)。

在上述檢測方法中，用SDS-LiCl法提取所述甘薯種薯RNA。

在上述檢測方法中，所述甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)進行所述PCR 的第一輪擴增的外引物為：

CS-F1：GACTCAGATTTGGAAACTAACC；

CS-R1：CGGACGTACTCTGATTTGC。

在上述檢測方法中，所述甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)進行所述PCR 的第一輪擴增的外引物為：

FM-F1：GCAGATTATGACGCACTTCAG；

FM-R1：CACACCCCTCATTCCTAAGAG。