[發(fā)明專利]一種甘薯種薯復(fù)合病毒病（SPVD）病原的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710855039.5
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN107385117B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張道微;董芳;張超凡;黃艷嵐;周虹;張亞
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南省作物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11
• 代理公司: 北京德恒律治知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11409
• 代理人: 章社杲;盧軍峰

1.一種甘薯種薯復(fù)合病毒病病原的檢測方法，其特征在于，所述甘薯種薯復(fù)合病毒病病原為甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒，

包括：

提取甘薯種薯RNA；

將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

以cDNA為模板，用擴(kuò)增所述甘薯褪綠矮化病毒的外引物和內(nèi)引物以及用擴(kuò)增所述甘薯羽狀斑駁病毒的外引物和內(nèi)引物進(jìn)行半巢式PCR的第一輪擴(kuò)增，得到第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物，并且用瓊脂糖凝膠電泳對第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第一輪檢測；

用瓊脂糖凝膠電泳分離第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物，并且回收目的DNA；以及

以回收的目的DNA為模板，用擴(kuò)增所述甘薯褪綠矮化病毒的內(nèi)引物以及用擴(kuò)增所述甘薯羽狀斑駁病毒的內(nèi)引物進(jìn)行半巢式PCR的第二輪擴(kuò)增，得到第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物，并且用瓊脂糖凝膠電泳對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二輪檢測，

擴(kuò)增所述甘薯褪綠矮化病毒的外引物序列為：

CS-F1：GACTCAGATTTGGAAACTAACC；

CS-R1：CGGACGTACTCTGATTTGC，

擴(kuò)增所述甘薯羽狀斑駁病毒的外引物序列為：

FM-F1：GCAGATTATGACGCACTTCAG；

FM-R1：CACACCCCTCATTCCTAAGAG，

擴(kuò)增所述甘薯褪綠矮化病毒的內(nèi)引物序列為：

CS-F1：GACTCAGATTTGGAAACTAACC；

CS-R2：GAGCTAACTGGTCTGAGG，

擴(kuò)增所述甘薯羽狀斑駁病毒的內(nèi)引物序列為：

FM-F2：GGTTGTTTGGTTTGGACGG；

FM-R1：CACACCCCTCATTCCTAAGAG，

其中，還利用內(nèi)參引物進(jìn)行所述半巢式PCR的第一輪擴(kuò)增，所述內(nèi)參引物為：

Actin-F：TGAGCAAGGAAATAACAG，

Actin-R：GCTAGAACATATAAGGTCTC；

H₂b-F：CAAGGTTCTCAAACAGGTC，

H₂b-R：GCTTGTAAACTTAGTCACG；

UBI-F：GAGGTTGAATCGTCAGAC，

UBI-R:GACTCATCCACCTTGTAG，

所述回收目的DNA是所述甘薯褪綠矮化病毒的目的DNA和所述甘薯羽狀斑駁病毒的目的DNA，并且所述甘薯褪綠矮化病毒的目的DNA和所述甘薯羽狀斑駁病毒的目的DNA均是半巢式PCR的第一輪外引物擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，用SDS-LiCl法提取所述甘薯種薯RNA。