[發明專利]轉基因構建物及其應用

在審

• 申請號: 201710853006.7
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107760714A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 王樹林;高江明;張明玲;劉珊;管華詩
• 申請（專利權）人: 青島海洋生物醫藥研究院股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 青島華慧澤專利代理事務所(普通合伙)37247
• 代理人: 劉娜,馬千會

技術領域

本發明屬于基因工程領域，特別涉及一種轉基因構建物及在制備p53基因全部閱讀框定點敲出和雙報告基因組織特異性表達分子影像小鼠中的應用。

背景技術

將外源基因導入動物機體或敲出動物機體內源性基因或深入探討基因功能需要轉基因技術，特別地，探討基因在動物機體的功能或改良生物性狀，研究基因在疾病特別是腫瘤發生、發展和轉移中的作用，需要采用轉基因過表達或基因敲出技術。

疾病相關動物模型在闡明基因功能、人類重大疾病發病機制及新藥研發等方面為人類健康與進步做出了巨大貢獻。腫瘤發生的組織特異性和器官選擇性相關機制研究是腫瘤研究領域的一大難題，目前符合臨床發病規律的動物模型十分匱乏。

熒光蛋白的發現和分子影像學技術的出現為腫瘤的早期發現，研究腫瘤發生、發展和轉移相關機制提供了重要手段和新途徑。

抑癌基因p53在大多數的人類癌癥如白血病，淋巴瘤，肉瘤，腦瘤，乳腺癌，胃腸道癌及肺癌等癌癥中常呈失活現象，其突變可高達50％以上，因此它是人類惡性腫瘤中最常見的基因改變。p53基因的產物具有調節細胞周期和細胞凋亡，參與DNA修復，調控腫瘤新生血管形成等功能。p53發生缺陷的腫瘤細胞不易發生凋亡，維持了腫瘤細胞的生存，也增加了對化療藥物和放射治療的耐藥性和不敏感性。因此，p53的生物學調控在調節正常細胞的生長，控制腫瘤形成及癌癥的治療中起著至關重要的作用。目前還沒有p53基因全部閱讀框敲出和雙熒光報告基因組織特異性表達基因編輯小鼠，因此本領域迫切需要建立和開發該種工具小鼠。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種轉基因構建物及制備p53定點敲出和雙熒光報告基因組織特異性表達分子影像小鼠中的應用。

本發明的另一個目的是將基因敲出、基因敲入技術同分子影像學技術有效結合起來，利用小動物成像系統等多種分子影像學技術手段實時無創傷檢測轉基因動物由于p53基因缺失對基因轉錄調控機制的影響；通過構建mCherry組織特異性表達模型，為研究腫瘤發生的器官選擇性分子機制及觀察腫瘤治療藥物的器官靶向性建立一個生物模型。

本發明的第一方面，提供一種轉基因構建物，所述的基因構建物包括包括小鼠位于第11 號染色體上的mTrp53基因(GenBank accession number:NM_0116403；Ensembl：

ENSMUSG00000059552)的從位于第二外顯子的翻譯起始密碼子ATG開始上游4953bp的5′同源臂基因組DNA片段、一種基因表達盒以及從位于第11外顯子的翻譯終止密碼子TGA 開始下游2487bp的3′同源臂基因組DNA片段。該基因構建物可與小鼠mTrp53基因的位于第二外顯子ATG開始上游4953bp和位于第11外顯子的終止密碼子TGA開始下游2487bp基因組DNA片段發生同源重組，將該區間基因組DNA片段敲出，同時將相等長度的基因表達盒DNA片段定點敲入到該區間。

其中所述5′同源臂基因組DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；其中所述3′同源臂基因組DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

上述方案中，所述的轉基因構建物將與小鼠位于第11號染色體上的mTrp53基因的第二外顯子的翻譯起始密碼子ATG開始上游4953bp和位于第11外顯子的翻譯終止密碼子TGA 開始下游2487bp基因組DNA片段發生同源重組，將該區間基因組DNA片段敲出，同時將相等長度的基因表達盒定點敲入到該區間，該轉基因構建物敲出基因組區間結構框架如圖二所示。

本發明的第二方面，提供了一種基因表達盒，所述的基因表達盒從5’至3’依次具有下述元件：螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)表達基因、Poly A元件、CAG啟動子元件、LoxP 位點序列、Poly A元件、LoxP位點序列、mCherry熒光蛋白表達基因、Poly A元件、neomycin 抗性表達基因。

上述方案中，所述的基因表達盒中的螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)表達基因受小鼠p53基因內源性啟動子調控。