[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710853006.7
• 申請(qǐng)日: 2017-09-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107760714A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王樹林;高江明;張明玲;劉珊;管華詩(shī)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島海洋生物醫(yī)藥研究院股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 青島華慧澤專利代理事務(wù)所(普通合伙)37247
• 代理人: 劉娜,馬千會(huì)

1.一種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物由5′同源臂基因組DNA片段、基因表達(dá)盒和3′同源臂基因組DNA片段組成；其中，5′同源臂基因組DNA片段來(lái)源于小鼠位于第11號(hào)染色體上的mTrp53基因(GenBank accession number：NM_0116403；Ensembl：ENSMUSG00000059552)從第二外顯子中的翻譯起始密碼子ATG開(kāi)始上游4953bp的基因組DNA片段；3′同源臂基因組DNA片段來(lái)源于該基因從位于第11外顯子中的翻譯終止密碼子TGA開(kāi)始下游2487bp的基因組DNA片段，該種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物結(jié)構(gòu)框架如圖一所示；其中所述5′同源臂基因組DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；所述3′同源臂基因組DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物將與小鼠位于第11號(hào)染色體上的mTrp53基因的第二外顯子的翻譯起始密碼子ATG開(kāi)始上游4953bp和位于第11外顯子的翻譯終止密碼子TGA開(kāi)始下游2487bp基因組DNA片段發(fā)生同源重組，將該區(qū)間基因組DNA片段敲出，同時(shí)將相等長(zhǎng)度的基因表達(dá)盒定點(diǎn)敲入到該區(qū)間，該轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物敲出基因組區(qū)間結(jié)構(gòu)框架如圖二所示。

3.一種基因表達(dá)盒，其特征在于，所述的基因表達(dá)盒從5’至3’依次具有下述元件：螢火蟲熒光素酶表達(dá)基因、Poly A元件、CAG啟動(dòng)子元件、LoxP位點(diǎn)序列、Poly A元件、LoxP位點(diǎn)序列、mCherry熒光蛋白表達(dá)基因、Poly A元件、neomycin抗性表達(dá)基因，該種基因表達(dá)盒結(jié)構(gòu)框架如圖三所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述的基因表達(dá)盒中的螢火蟲熒光素酶表達(dá)基因的表達(dá)受小鼠位于p53第二外顯子ATG上游內(nèi)源性啟動(dòng)子元件調(diào)控。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述的基因表達(dá)盒中的mCherry熒光蛋白表達(dá)基因的表達(dá)受基因表達(dá)盒中的CAG啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)；所述的基因表達(dá)盒中CAG啟動(dòng)子元件和mCherry熒光蛋白基因之間存在的LoxP位點(diǎn)序列、Poly A元件、LoxP位點(diǎn)序列，使得正常情況下CAG啟動(dòng)子無(wú)法啟動(dòng)mCherry熒光蛋白表達(dá)基因的表達(dá)；所述的基因表達(dá)盒中的mCherry熒光蛋白表達(dá)基因的表達(dá)受外源Cre轉(zhuǎn)基因的(組織)特異性表達(dá)。

6.一種載體，其特征在于，所述載體含有或權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，或權(quán)利要求3所述的基因表達(dá)盒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，所述載體選自：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、病毒、或動(dòng)物細(xì)胞載體、穿梭載體。

8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的載體，或其染色體整合有權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，或其染色體整合有權(quán)利要求4所述的基因表達(dá)盒。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞選自下組：原核細(xì)胞、低等真核細(xì)胞、或高等真核細(xì)胞。

10.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為小鼠細(xì)胞。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，或權(quán)利要求3所述的基因表達(dá)盒的用途，其特征在于，用于敲出小鼠p53基因的整個(gè)編碼閱讀框，同時(shí)在該位點(diǎn)敲入等長(zhǎng)的基因表達(dá)盒，使得表達(dá)盒中的螢火蟲熒光素酶表達(dá)基因的表達(dá)受小鼠位于p53第二外顯子ATG上游內(nèi)源性啟動(dòng)子元件調(diào)控，mCherry熒光蛋白表達(dá)基因的表達(dá)受外源性Cre轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)調(diào)控。

12.一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提供轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物細(xì)胞，所述動(dòng)物細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的載體，或其染色體整合有權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，或其染色體整合有權(quán)利要求3所述的基因表達(dá)盒；

(2)將步驟(1)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生為動(dòng)物，從而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

13.一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的用途，所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是利用權(quán)利要求12所述的方法制備的，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物沒(méi)有內(nèi)源性p53蛋白的表達(dá)，可用于研究p53表達(dá)缺失對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物遺傳、發(fā)育、生長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的影響。