[發明專利]轉基因構建物及其應用

在審

• 申請號: 201710853006.7
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107760714A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 王樹林;高江明;張明玲;劉珊;管華詩
• 申請（專利權）人: 青島海洋生物醫藥研究院股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 青島華慧澤專利代理事務所(普通合伙)37247
• 代理人: 劉娜,馬千會

1.一種轉基因構建物，其特征在于，所述構建物由5′同源臂基因組DNA片段、基因表達盒和3′同源臂基因組DNA片段組成；其中，5′同源臂基因組DNA片段來源于小鼠位于第11號染色體上的mTrp53基因(GenBank accession number：NM_0116403；Ensembl：ENSMUSG00000059552)從第二外顯子中的翻譯起始密碼子ATG開始上游4953bp的基因組DNA片段；3′同源臂基因組DNA片段來源于該基因從位于第11外顯子中的翻譯終止密碼子TGA開始下游2487bp的基因組DNA片段，該種轉基因構建物結構框架如圖一所示；其中所述5′同源臂基因組DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；所述3′同源臂基因組DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

2.根據權利要求1所述的轉基因構建物，其特征在于，所述的轉基因構建物將與小鼠位于第11號染色體上的mTrp53基因的第二外顯子的翻譯起始密碼子ATG開始上游4953bp和位于第11外顯子的翻譯終止密碼子TGA開始下游2487bp基因組DNA片段發生同源重組，將該區間基因組DNA片段敲出，同時將相等長度的基因表達盒定點敲入到該區間，該轉基因構建物敲出基因組區間結構框架如圖二所示。

3.一種基因表達盒，其特征在于，所述的基因表達盒從5’至3’依次具有下述元件：螢火蟲熒光素酶表達基因、Poly A元件、CAG啟動子元件、LoxP位點序列、Poly A元件、LoxP位點序列、mCherry熒光蛋白表達基因、Poly A元件、neomycin抗性表達基因，該種基因表達盒結構框架如圖三所示。

4.根據權利要求3所述的基因表達盒，其特征在于，所述的基因表達盒中的螢火蟲熒光素酶表達基因的表達受小鼠位于p53第二外顯子ATG上游內源性啟動子元件調控。

5.根據權利要求3所述的基因表達盒，其特征在于，所述的基因表達盒中的mCherry熒光蛋白表達基因的表達受基因表達盒中的CAG啟動子元件調節；所述的基因表達盒中CAG啟動子元件和mCherry熒光蛋白基因之間存在的LoxP位點序列、Poly A元件、LoxP位點序列，使得正常情況下CAG啟動子無法啟動mCherry熒光蛋白表達基因的表達；所述的基因表達盒中的mCherry熒光蛋白表達基因的表達受外源Cre轉基因的(組織)特異性表達。

6.一種載體，其特征在于，所述載體含有或權利要求1所述的轉基因構建物，或權利要求3所述的基因表達盒。

7.根據權利要求6所述的載體，其特征在于，所述載體選自：細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、病毒、或動物細胞載體、穿梭載體。

8.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求6所述的載體，或其染色體整合有權利要求1所述的轉基因構建物，或其染色體整合有權利要求4所述的基因表達盒。

9.根據權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞選自下組：原核細胞、低等真核細胞、或高等真核細胞。

10.如權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為小鼠細胞。

11.根據權利要求1所述的轉基因構建物，或權利要求3所述的基因表達盒的用途，其特征在于，用于敲出小鼠p53基因的整個編碼閱讀框，同時在該位點敲入等長的基因表達盒，使得表達盒中的螢火蟲熒光素酶表達基因的表達受小鼠位于p53第二外顯子ATG上游內源性啟動子元件調控，mCherry熒光蛋白表達基因的表達受外源性Cre轉基因的組織特異性表達調控。

12.一種制備轉基因動物的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提供轉基因的動物細胞，所述動物細胞含有權利要求6所述的載體，或其染色體整合有權利要求1所述的轉基因構建物，或其染色體整合有權利要求3所述的基因表達盒；

(2)將步驟(1)所述的轉基因細胞再生為動物，從而獲得轉基因動物。

13.一種轉基因動物的用途，所述的轉基因動物是利用權利要求12所述的方法制備的，其特征在于，所述的轉基因動物沒有內源性p53蛋白的表達，可用于研究p53表達缺失對轉基因動物遺傳、發育、生長、腫瘤發生和轉移的影響。