[發(fā)明專利]重組CHO細(xì)胞的貼壁微載體懸浮培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710851893.4
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107523534B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 付立家;付建家;馬筠;趙敏姿
• 申請（專利權(quán)）人: 北京亞東生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體公開了一種重組CHO細(xì)胞的貼壁微載體懸浮培養(yǎng)方法，包括如下步驟：(1)使用細(xì)胞生長液對重組CHO細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將傳代培養(yǎng)后的重組CHO細(xì)胞，按照1～5×10⁵個細(xì)胞/mL的接種量接種至帶有微載體的生物反應(yīng)器；(2)進(jìn)行重組CHO細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)；(3)當(dāng)重組CHO細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白含量≥0.5mg/L時，每天流加細(xì)胞生長液；1周后，每天流加細(xì)胞維持液；培養(yǎng)時間為25～30天；其中，所述細(xì)胞生長液為含有10％～16％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基；所述細(xì)胞維持液為含有4％～8％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。本發(fā)明采用貼壁微載體懸浮培養(yǎng)方法，并使用所述細(xì)胞生長液和細(xì)胞維持液對重組CHO細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)目的蛋白，可顯著提高目的蛋白的產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說，涉及重組CHO細(xì)胞的貼壁微載體懸浮培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒感染是一種嚴(yán)重威脅健康的全球性問題。乙型肝炎是由病毒引起的疾病，全球至少2億人感染過乙肝病毒，其中3500萬至4000萬人為慢性乙肝病毒攜帶者。亞洲、非洲、部分的東歐和南歐是乙肝病毒的高發(fā)區(qū)，西歐、南美及大洋洲各國的乙肝感染率較低。我國是乙肝高發(fā)地區(qū)，約有1.2億人攜帶乙肝病毒，其中25％的感染者為慢性乙型肝炎，每年大約有50萬至70萬人死于急性乙型肝炎引發(fā)的肝硬化和肝癌。

肝癌是世界上第五大常見的癌癥，癌癥致死率排在第三位。乙肝的治愈至今在全球仍然是一個難題，所以乙肝的預(yù)防則更為重要。通過接種乙肝疫苗，95％的兒童和成人得到了有效的保護(hù)。

目前國內(nèi)外普遍使用酵母或中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)乙型肝炎疫苗。CHO細(xì)胞表達(dá)疫苗的種類不多，多數(shù)處于研究階段。目前只有CHO表達(dá)乙肝疫苗已投入生產(chǎn)，這是除酵母乙肝疫苗以外，唯一已用于人類使用的基因工程亞單位疫苗。酵母表達(dá)乙肝疫苗由于生產(chǎn)工藝成熟簡單(生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng))，使得酵母生產(chǎn)乙肝疫苗的成本比較低廉，所以目前市場上使用的乙肝疫苗大多數(shù)是酵母乙肝疫苗。但是酵母系統(tǒng)本身存在著許多缺陷，最重要的一點(diǎn)，酵母不能模擬蛋白在人體肝細(xì)胞中的翻譯后修飾、蛋白折疊、大分子組裝以及糖基化。這些特點(diǎn)正是抗原在動物細(xì)胞中引起免疫反應(yīng)所必須的。而CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝抗原決定簇與人體來源的乙肝表面抗原高度相似。在免疫原性方面，CHO生產(chǎn)的乙肝疫苗的免疫原性與血源疫苗沒有差異，明顯優(yōu)于酵母重組疫苗。調(diào)查顯示，新生兒接種國產(chǎn)乙肝CHO疫苗第1年的抗HBs陽性率為98.25％，抗體GMT為77.64，而血源疫苗免疫后第1年抗HBs陽性率在73.3％～93.5％之間。與酵母重組疫苗比較，更低劑量的CHO乙肝重組疫苗在T細(xì)胞水平產(chǎn)生更高的免疫原性，這些疫苗刺激T細(xì)胞產(chǎn)生幫助引起更高的血清轉(zhuǎn)化率和更高的抗HBs滴度。在安全性方面，根據(jù)現(xiàn)有的安全性記載，動物細(xì)胞表達(dá)的生物產(chǎn)品尤其CHO表達(dá)的產(chǎn)物的安全性很好，在已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床或生產(chǎn)的動物細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗的使用中，沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副反應(yīng)。其中我國主導(dǎo)研發(fā)的CHO-C28細(xì)胞株，用于生產(chǎn)乙肝疫苗近30年，從未出現(xiàn)過安全事故。

由于傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝是在有血清的情況下，采用大型轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)重組CHO細(xì)胞，生產(chǎn)效率低(1-5mg·L^-1·d^-1)，較重組酵母表達(dá)的疫苗成本要高，所以占市場份額相對較小。目前已有很多公司和機(jī)構(gòu)試圖對培養(yǎng)表達(dá)HBsAg的重組CHO細(xì)胞進(jìn)行無血清馴化，并進(jìn)一步對其進(jìn)行懸浮培養(yǎng)馴化，希望實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器高密度懸浮培養(yǎng)，來提高重組蛋白產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本。滕小锘等(表達(dá)乙型肝炎表面抗原的重組CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化及生物反應(yīng)器培養(yǎng)，中國生物制品學(xué)雜志，2010年10月)在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中，灌注培養(yǎng)的重組CHO細(xì)胞表達(dá)的HBsAg產(chǎn)率為0.70mg·L^-1·d^-1，分批和流加培養(yǎng)時為0.30mg·L^-1·d^-1。但也許由于HBsAg本身的特性，針對表達(dá)乙型肝炎表面抗原的重組CHO細(xì)胞的懸浮優(yōu)化或無血清優(yōu)化，并無明顯效果，仍低于傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的產(chǎn)量。