[發(fā)明專利]重組CHO細胞的貼壁微載體懸浮培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710851893.4
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107523534B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 付立家;付建家;馬筠;趙敏姿
• 申請（專利權(quán)）人: 北京亞東生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

1.一種重組CHO細胞的貼壁微載體懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)使用細胞生長液對重組CHO細胞進行傳代培養(yǎng)，將傳代培養(yǎng)后的重組CHO細胞，按照1～5×10⁵個細胞/mL的接種量接種至帶有微載體的生物反應(yīng)器；

(2)進行重組CHO細胞的擴增培養(yǎng)；

(3)當重組CHO細胞表達的目的蛋白含量≥0.5mg/L時，每天流加30％培養(yǎng)體積的細胞生長液；1周后，每天流加50％培養(yǎng)體積的細胞維持液；保持葡萄糖含量為0.7-1.2g/L；培養(yǎng)時間為25～30天；

其中，所述細胞生長液為含有10％～16％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基；所述細胞維持液為含有4％～8％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基；

在開始流加細胞維持液時，第1～4天流加的細胞維持液中新生牛血清含量分別為8％、5％、4％和4％；從第5天起，按照新生牛血清含量分別為5％、4％和4％的循環(huán)，流加細胞維持液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)具體為：復(fù)蘇重組CHO細胞株，復(fù)蘇后細胞存活率應(yīng)不低于85％，24h后置換細胞生長液，然后放于37℃繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，待方瓶細胞成致密單層后，用胰蛋白酶消化傳代，傳代比例為1:3～1:4，2～3天換生長液一次；傳代培養(yǎng)所得細胞經(jīng)消化后可作為種子接種到生物反應(yīng)器中，接種后細胞密度為1～5×10⁵個細胞/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)具體為：在溫度37℃、氣體壓力10psi、pH 6.8-7.2、DO 50-60％條件下進行CHO細胞的擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中保持葡萄糖含量為2-3g/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，步驟(2)擴增培養(yǎng)開始時，轉(zhuǎn)速為30rpm，3小時后轉(zhuǎn)速調(diào)至50rpm，1天后調(diào)至70rpm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)流加細胞維持液后，調(diào)低培養(yǎng)溫度為35℃，下調(diào)DO到40-50％，維持pH為7.0-7.4。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體為聚酯圓片。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～3、6任一項所述的方法，其特征在于，所述重組CHO細胞為表達乙肝抗原的CHO細胞。