[發(fā)明專利]一種結(jié)合AUDG和自避分子識別系統(tǒng)的多交叉恒溫擴(kuò)增方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710848631.2
• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107523624B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉長蕓;王毅;王艷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;G01N33/68;G01N33/558
• 代理公司: 北京市眾天律師事務(wù)所 11478
• 代理人: 李新軍

本發(fā)明公開了一種結(jié)合南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶(AUDG)和自避分子識別系統(tǒng)(SAMRS)的多交叉恒溫擴(kuò)增方法，所述方法對多交叉置換擴(kuò)增中的引物3’端倒數(shù)第二位堿基至倒數(shù)第五位堿基的4個堿基進(jìn)行SAMRS修飾，并在擴(kuò)增引物C1或C2的5’端標(biāo)記半抗原，在擴(kuò)增系統(tǒng)中引入AUDG酶、脫氧尿嘧啶和生物素化的脫氧胞嘧啶，以多交叉置換擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合高分子納米生物傳感檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。所述方法針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的IS6110特異序列的擴(kuò)增產(chǎn)物能被高分子納米生物傳感器可視化檢測。所述方法便捷、快速、敏感、特異，適宜于各種核苷酸片段檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種多交叉置換恒溫擴(kuò)增檢測微生物目的基因的方法，屬于微生物和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，核酸擴(kuò)增是一種不可缺少的技術(shù)，已經(jīng)廣泛運(yùn)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷、考古研究、流行病研究、轉(zhuǎn)基因研究等領(lǐng)域。在已經(jīng)發(fā)展的核酸擴(kuò)增技術(shù)中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是第一個被建立的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有劃時代意義，該技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物相關(guān)領(lǐng)域。然而，PCR技術(shù)進(jìn)行核酸擴(kuò)增時，受到實驗室條件的限制，依賴于復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)設(shè)備。除此之外，PCR產(chǎn)物的檢測比較復(fù)雜，需要一套復(fù)雜的流程及設(shè)備。這些劣勢限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，尤其在經(jīng)濟(jì)落后的地區(qū)及快速診斷領(lǐng)域。因此，對于生物及醫(yī)學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域而言，非常有必要發(fā)展簡單、快速、敏感的核酸擴(kuò)增方法。為了克服PCR擴(kuò)增技術(shù)的劣勢，應(yīng)運(yùn)而生了許多恒溫擴(kuò)增技術(shù)。與PCR技術(shù)比較，恒溫擴(kuò)增技術(shù)不依賴于熱循環(huán)擴(kuò)增設(shè)備，反應(yīng)速度快，敏感性好。因此，恒溫擴(kuò)增技術(shù)有利于實現(xiàn)快速擴(kuò)增、現(xiàn)場診斷及便捷檢測。到目前為止，已發(fā)展的恒溫擴(kuò)增技術(shù)有10余種，應(yīng)用較為廣泛的有環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)、交叉擴(kuò)增(CPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫擴(kuò)增(HDA)等。然而，這些恒溫技術(shù)實現(xiàn)核酸擴(kuò)增需要多種酶同時工作，依賴于昂貴的試劑、復(fù)雜的操作步驟。因此這些恒溫擴(kuò)增方法的實用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速診斷領(lǐng)域及欠發(fā)達(dá)地區(qū)。

為了克服PCR技術(shù)及現(xiàn)有恒溫擴(kuò)增技術(shù)的劣勢，實現(xiàn)敏感、便捷、快速及特異的擴(kuò)增核酸序列，發(fā)明人近期已經(jīng)建立了一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，命名為多交叉置換擴(kuò)增(Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)，相關(guān)內(nèi)容公開于CN104946744A，該專利文件作為現(xiàn)有技術(shù)文件構(gòu)成本申請說明書的一個部分。MCDA在恒溫條件下實現(xiàn)核酸擴(kuò)增，僅使用一種恒溫置換酶、擴(kuò)增速度快、反應(yīng)靈敏、特異性高。

類似于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)和交叉擴(kuò)增(CPA)，MCDA的技術(shù)瓶頸在結(jié)果的判讀，即擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。到目前為止，最常見的產(chǎn)物檢測手段主要包括顏色指示劑、電泳、實時濁度。然而，這三種檢測技術(shù)僅僅適用于單重檢測(即單一靶標(biāo)的檢測)。此外，顏色指示劑判讀擴(kuò)增產(chǎn)物時，會出現(xiàn)模擬兩可的結(jié)果，電泳判讀結(jié)果時耗時較長，容易出現(xiàn)交叉污染，不適合于現(xiàn)場檢測，實施濁度判讀時需要特殊的儀器設(shè)備。為了克服這三種檢測技術(shù)的劣勢，使MCDA技術(shù)在生物、醫(yī)藥及衛(wèi)生領(lǐng)域應(yīng)用更廣泛、更經(jīng)濟(jì)。近期，發(fā)明人以MCDA為基礎(chǔ)，將MCDA技術(shù)與納米生物檢測技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了依賴MCDA技術(shù)、實現(xiàn)快速、敏感檢測的納米生物傳感技術(shù)，該技術(shù)被命名為多交叉恒溫擴(kuò)增結(jié)合金納米生物傳感的核酸診斷技術(shù)(Multiple Cross Displacement Amplification label-based gold NanoparticlesLateral Flow Biosensor，MCDA-LFB)，相關(guān)內(nèi)容公開于CN201610872509.4；CN201610942289.8；CN201610982015.1；CN201710566164.4，這些專利文件作為現(xiàn)有技術(shù)文件構(gòu)成本申請說明書的一個部分。