[發(fā)明專利]一種結(jié)合AUDG和自避分子識別系統(tǒng)的多交叉恒溫?cái)U(kuò)增方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710848631.2 | 申請日： | 2017-09-19 |
| 公開（公告）號： | CN107523624B | 公開（公告）日： | 2020-06-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 葉長蕓;王毅;王艷 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 |
| 主分類號： | C12Q1/6844 | 分類號： | C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;G01N33/68;G01N33/558 |
| 代理公司： | 北京市眾天律師事務(wù)所 11478 | 代理人： | 李新軍 |
| 地址： | 102206 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 結(jié)合 audg 分子 識別 系統(tǒng) 交叉 恒溫 擴(kuò)增 方法 | ||
1.一種非診斷目的的多交叉恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合高分子納米生物傳感檢測目的基因的方法，所述方法包括以下步驟：
(1)提取待檢測樣品的基因組；
(2)提供在3’端倒數(shù)第二位堿基至倒數(shù)第五位堿基的4個(gè)堿基被SAMRS修飾的引物，A被修飾為2-氨基嘌呤，T被修飾為2-硫代胸腺嘧啶，C被修飾為N4-乙酰胞嘧啶，G被修飾為次黃嘌呤，所述引物包括：置換引物F1和F2，所述置換引物F1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述置換引物F2的序列如SEQ ID NO：2所示；交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQID NO：3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO：4所示；提供擴(kuò)增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQ ID NO：5所示，引物C2的序列如SEQ ID NO：6所示；引物D1的序列如SEQ ID NO：7所示，引物D2的序列如SEQ ID NO：8所示，引物R1的序列如SEQ ID NO：9所示，引物R2的序列如SEQ ID NO：10所示，同時(shí)提供在上述任一引物的5’端標(biāo)記有半抗原的修飾引物；
(3)在南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶、鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調(diào)節(jié)劑、引物、dNTP，以及生物素化的脫氧尿嘧啶存在下，使用待檢測樣品的基因組核酸作為模板恒溫?cái)U(kuò)增DNA；
(4)使用高分子納米生物傳感器檢測步驟(3)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在5’端標(biāo)記有半抗原的修飾引物為擴(kuò)增引物C1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述在5’端標(biāo)記的半抗原為熒光素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子納米生物傳感器包括一背板(1)，在所述背板(1)上依次設(shè)置裝有樣品板(2)、結(jié)合板(3)、硝酸纖維素膜(4)及吸水板(5)，在所述硝酸纖維素膜(4)上依次設(shè)置檢測線(41)及控制線(42)，在結(jié)合板(3)、檢測線(41)、及控制線(42)區(qū)域依次包被有色基團(tuán)修飾的親和素化的高分子納米粒子(6)、抗熒光素抗體(7)及生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白(8)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增是在60-62℃的環(huán)境中進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增是在61℃的環(huán)境中進(jìn)行的。
7.一組用于恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群IS6110特異序列的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQ ID NO：1所示的置換引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置換引物F2，如SEQ ID NO：3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：5所示的擴(kuò)增引物C1，如SEQ ID NO：6所示的擴(kuò)增引物C2，如SEQ ID NO：7所示的擴(kuò)增引物D1，如SEQ ID NO：8所示的擴(kuò)增引物D2，如SEQ ID NO：9所示的擴(kuò)增引物R1，如SEQ ID NO：10所示的擴(kuò)增引物R2，同時(shí)提供在上述任一引物的5’端標(biāo)記有半抗原的修飾引物，A被修飾為2-氨基嘌呤，T被修飾為2-硫代胸腺嘧啶，C被修飾為N4-乙酰胞嘧啶，G被修飾為次黃嘌呤。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物序列，其特征在于，在5’端標(biāo)記有半抗原的修飾引物為擴(kuò)增引物C1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的引物序列，其特征在于，所標(biāo)記的半抗原為熒光素。
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