[發明專利]高熒光強度的熒光探針的合成方法及用其進行β受體激動劑檢測的方法

有效

• 申請號: 201710847777.5
• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107505301B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 周鑫魁;洪霞;錢瀅文;高志瑩;王杰斌;何海寧
• 申請（專利權）人: 甘肅省商業科技研究所有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N30/02
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 張克勤

1.一種高熒光強度的熒光探針的合成方法，其特征在于：以2,3-萘二胺、苯甲酰氯為反應物，以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為催化劑制得；具體步驟為：

A、按質量比分別稱取反應物2,3-萘二胺7.8-8.2份，苯甲酰氯6.8-7.2份，催化劑1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽0.8-1.2份，均勻攪拌30min，得到混合溶液；

B、用14.8-15.2份pH值為2的鹽酸水溶液萃取上述混合溶液，3次；合并鹽酸溶液;

C、用8-12%氫氧化鈉水溶液調節鹽酸溶液pH值為10，此時會析出白色晶體狀沉淀,過濾，用冷水多次洗滌濾餅;

D、用45-55%的乙醇水溶液將濾餅重結晶，干燥，得到白色針狀晶體，即為2-苯基萘并咪唑;

E、取6.8-7.2份氯磺酸于圓底燒瓶中，在冰鹽浴中充分冷卻，加入步驟D制得的2-苯基萘并咪唑2.8-3.2份，充分攪拌，60℃加熱溶解10min迅速倒入冰水中，靜止，此時有針狀沉淀析出，過濾，用冰水洗滌濾餅，干燥，得到黃色針狀晶體1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑。

2.用權利要求1所述的熒光探針進行檢測的方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟1：試劑準備，將0.2mol/L鹽酸溶液，20g/L氯化鈉溶液，甲醇按體積比1:1:1混合，得到樣品提取液，該樣品提取液可以有效的從動物源性制品中將目標物萃取到液相中，又不會溶解大量油脂等雜質影響實驗結果；

配制0.1mol/L碳酸鈉水溶液，并用鹽酸調節其pH值為9.5-10.1，得到衍生緩沖液，該緩沖液保證衍生試劑有效的與目標物中的仲胺基反應，不與酚類物質，醇類物質反應，讓衍生試劑專一性較強；稱取1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑0.2g溶于100mL丙酮中，得到衍生劑溶液；

步驟2：稱取5.00g樣品于離心管中，加入25mL樣品提取液，10000rpm勻漿1min，4℃，8000rpm離心5min，得到上清液和沉淀物，將該上清液轉入雞心瓶中，用5mL提取液洗滌該沉淀物，將洗滌后液體合并到盛放上清液的雞心瓶中，50℃旋轉蒸發至5mL以下，加入10mL正己烷，搖晃1min，靜置分層，棄去上層正己烷層，將下層用水定容至5.00mL；

步驟3：取樣液1mL于具塞試管中，加入1mL衍生緩沖液，1mL衍生劑溶液，加塞，避光，90℃反應15min，加入0.05mL濃鹽酸，搖勻后，過濾孔直徑為0.45μm的濾膜；然后進行高效液相色譜儀測定；

步驟4：以水為溶劑，配制各不同質量體積濃度的七種β-受體激動劑系列混合標準溶液，該七種β-受體激動劑系列混合標準溶液的質量體積濃度均為：1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；將七種β-受體激動劑系列混合標準溶液按步驟3進行衍生處理，于附帶熒光檢測器的高效液相色譜儀中測定；由色譜圖得到系列標準溶液中七種β-受體激動劑的熒光衍生物在色譜條件下的出生時間和不同濃度的峰面積，并以標準溶液質量體積濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪七種β-受體激動劑標準溶液的工作曲線；

步驟5：根據測得的樣品制備液的峰面積值，從步驟4繪制的系列標準溶液的工作曲線上找到峰面積值對應的七種β-受體激動劑的含量，計算待測樣品中七種β-受體激動劑的含量。

3.根據權利要求2所述的熒光探針進行檢測的方法，其特征在于：所述步驟3和步驟4中的色譜條件為，色譜柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流動相：pH=3.5乙酸銨緩沖液40v+乙腈60v；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；激發波長：365 nm，發射波長：405nm。