[發(fā)明專利]一種檢測EB病毒的多重熒光定量PCR方法及試劑盒

有效

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• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107354239B
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發(fā)明（設計）人: 曹素梅;陳曉霞;謝尚杭
• 申請（專利權）人: 中山大學腫瘤防治中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

本發(fā)明公開了一種檢測EB病毒的多重熒光定量PCR方法及試劑盒，所述試劑盒包括檢測EBNA1，Bam HI?W基因及人內(nèi)參基因的檢測引物對和探針，其序列依次如SEQ ID NO：1～9所示。本發(fā)明通過綜合上述EBNA1基因和Bam HI?W基因兩個基因優(yōu)勢并且加上人內(nèi)參基因做多重熒光定量PCR的方法，即用內(nèi)參基因來檢測標本DNA提取效果可行性，用雙目標基因?qū)崿F(xiàn)對EB病毒精準定性和定量分析，與現(xiàn)有的商用試劑盒相比，具有更高的靈敏度和特異性，且本發(fā)明的熒光定量PCR技術具有操作簡單、時間短、試劑耗材來源廣、成本低、熒光PCR體系試劑通性強等優(yōu)勢，具有較大的應用前景。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域。更具體地，涉及一種檢測EB病毒的多重熒光定量PCR方法及試劑盒。

背景技術

EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地將Bμrkitt非洲兒童淋巴瘤細胞通過體外懸浮培養(yǎng)而建株，并在建株細胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒，認為該病毒是多種惡性腫瘤（如鼻咽癌）的病因之一，它主要感染人類口咽部的上皮細胞和B淋巴細胞。在中國南方鼻咽癌患病人群中大多都檢測到有EB病毒基因組存在。故早期檢測到EB病毒的存在與鼻咽癌發(fā)生早期事件具有高度相關性，所以建立一種特異檢測EB病毒存在方法是至關重要的。

目前商品化檢測試劑盒或相關研究主要是ELISA檢測方法和EB病毒核酸檢測方法，前者檢測特異性低，假陽性高，對于后者雖然是使用實時熒光定量的PCR特異檢測EB病毒的核酸，但是現(xiàn)在的方法一般是使用單一目標區(qū)域的定性或定量分析，如單獨的EBNA1或Bam HI-W，這樣檢測的準確性和特異性往往不高，因為EB病毒核酸拷貝數(shù)變異大，特別是Bam HI-W序列不同人群拷貝數(shù)差異很大，單獨使用不能準確定量，但由于其拷貝數(shù)一般都在兩個拷貝數(shù)以上，對早期中EB病毒感染量比較少的人群也能滿足檢測的靈敏度（10pg/μL都能檢測），故比較適合定性分析，而EBNA1區(qū)域幾乎所有人群都是固定單拷貝數(shù)的，即屬于低拷貝數(shù)的基因，對于早期中EBV感染量比較少的人群檢測靈敏度不足，但比較適合用于定量分析。

多重PCR（mμLtiplex PCR），又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應

另外目前現(xiàn)有的研究方法或試劑盒均為精細分類的熒光定量PCR方法。如單重PCRmix只適合一種核酸染料（如SYBR）或者一條Taq man探針的實時熒光定量PCR或者一種試劑盒只適合一類標本的核酸定量分析，如果要做不同標本的熒光定量分析，必須買多種熒光定量PCR試劑盒，使用范圍嚴格受到限制，通用性。而且現(xiàn)有選用單一的EB病毒目標區(qū)域的定性定量分析方法或試劑盒都是國外進口的試劑如羅氏，試劑比較昂貴、操作流程復雜、對實驗過程操作要求較高、采購周期較長等缺陷會不利于實際科學研究和項目開展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有EB病毒檢測方法準確性和特異性不高，使用范圍受限，且操作復雜、成本高等缺陷和不足，提供一種綜合上述EBNA1基因和Bam HI-W基因兩個基因優(yōu)勢并且加上人內(nèi)參基因β-actin做多重熒光定量PCR的方法，即用內(nèi)參基因來檢測標本DNA提取效果可行性，用雙目標基因?qū)崿F(xiàn)對EB病毒精準定性和定量分析。

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測EB病毒的多重熒光定量PCR引物和探針。

本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測EB病毒的多重熒光定量PCR方法。

本發(fā)明的再一目的是提供一種檢測EB病毒的試劑盒。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案給予實現(xiàn)的：