[發明專利]一種鑒定家養綿羊是否含有盤羊血緣的方法

有效

• 申請號: 201710847511.0
• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107766698B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 周明亮;楊平貴;陳明華;龐倩
• 申請（專利權）人: 四川省草原科學研究院
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B20/20;G16B10/00;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種鑒定家養綿羊是否含有盤羊血緣的方法，其特征在于，所述鑒定家養綿羊是否含有盤羊血緣的方法包括以下步驟：

步驟一，賈洛羊血樣樣品或組織樣品的采集，個體DNA提?。徊捎妙i靜脈采血5-8mL，注入加有肝素鈉抗凝劑的一次性真空采血管中，180°輕輕顛倒混勻5-6次，共采集了62個個體，及時運回實驗室，-20℃保存備用；

步驟二，依據NCBI數據庫中登錄號為NC001941的家養綿羊mtDNA全序列，采用Primer5.0設計引物，以賈洛羊的DNA樣本為模板，進行mtDNA D-loop全序列的PCR擴增；所述引物包括上游引物SEQ ID NO：1和下游引物SEQ ID NO：2；所述PCR擴增的PCR反應體系總體積為50μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，超純水H₂O 21.0μL；PCR反應程序為預變性94℃5min，變性94℃30s，退火58℃，延伸72℃90s，共34個循環，72℃延伸5min，16℃hold；

步驟三，擴增的mtDNA D-loop的PCR產物，送測序公司進行mtDNA D-loop序列的測序，DNAstar軟件進行賈洛羊mtDNA D-loop的測序結果進行整理、拼接、組裝；

步驟四，從NCBI數據庫中下載家養綿羊mtDNA D-loop單倍型A和單倍型B的序列及歐洲野綿羊-摩弗侖羊、東方盤羊、羱羊、盤羊維式亞種、盤羊哈薩克斯坦亞種、盤羊蒙古亞種、盤羊西藏亞種和盤羊指名亞種序列；

步驟五，采用ClustalW軟件對家養綿羊mtDNA D-Loop單倍型A和B、NCBI數據庫中下載的mtDNA D-Loop全序列及賈洛羊的mtDNA D-Loop全序列進行多重序列比對，比對后的序列再用Mega 6.06軟件的Neighbor-Joining程序構建進化關系樹，判斷摩弗侖羊、東方盤羊、羱羊及盤羊各亞種是否與賈洛羊的單倍型A、單倍型B和單倍型C歸為一類，確定賈洛羊與摩弗侖羊、東方盤羊、羱羊及盤羊各亞種間存在共同的祖先或共有血緣關系。