[發(fā)明專利]一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710845163.3
• 申請(qǐng)日: 2015-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107475228B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張娟;方真;堵國(guó)成;陳堅(jiān);劉柏宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/52
• 分類號(hào): C12N9/52;C12N15/57;C12N15/70;C11D3/386;D06M16/00;A23K20/189
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開(kāi)了一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)分析得出最佳突變點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得角蛋白酶酶活和底物專一性提高的優(yōu)秀突變體。該角蛋白酶及其突變體能夠有效水解羽毛，羊毛等非水溶性角蛋白底物，可用于皮革紡織工業(yè)和飼料工業(yè)。

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮椋?01510119684.1，申請(qǐng)日為：2015年3月18日，申請(qǐng)名稱為：一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法，屬于酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

角蛋白酶(Keratinase)為一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由真菌、放線菌和細(xì)菌等多種微生物產(chǎn)生。角蛋白酶在食品、醫(yī)藥、飼料、精化和制革等工業(yè)中廣泛應(yīng)用，具有嫩化肉類、生產(chǎn)高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品、免疫制劑和飼料添加劑以及美容、軟化皮革等作用，并可導(dǎo)致瘋牛病和人類克雅氏癥的阮蛋白(Prion)的降解。雖然角蛋白酶有著巨大的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值，但是從野生菌中篩選出的角蛋白酶熱穩(wěn)定性差，底物專一性不高，大大降低了角蛋白酶的開(kāi)發(fā)和運(yùn)用。目前已經(jīng)報(bào)道的角蛋白酶基因主要來(lái)自國(guó)外的一株地衣芽胞桿菌的kerA基因。本發(fā)明將來(lái)自嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1的角蛋白酶KerSMD進(jìn)行分子改造，提高角蛋白酶對(duì)酪蛋白或羽毛的底物專一性，對(duì)角蛋白酶的規(guī)模化生產(chǎn)及推廣具有深遠(yuǎn)的技術(shù)指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體，是將來(lái)源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的第180位的絲氨酸替換成甘氨酸，或者第208位的谷氨酸替換為絲氨酸，或者第215位的酪氨酸替換成甘氨酸或者丙氨酸或者絲氨酸或者苯丙氨酸，或者第180位的絲氨酸替換成甘氨酸同時(shí)將第215位的酪氨酸替換成丙氨酸或者絲氨酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述來(lái)源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶突變體為第180位絲氨酸替換成甘氨酸的S180G。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶突變體為第208位谷氨酸替換為絲氨酸的E208S。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶突變體為第215位酪氨酸替換成甘氨酸或者絲氨酸或者丙氨酸的Y215G、Y215S、Y215A。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶組合突變體為第180位絲氨酸替換成甘氨酸和215位的酪氨酸替換成丙氨酸的S180G/Y215A。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶組合突變體為第180位絲氨酸替換成甘氨酸和215位的酪氨酸替換成絲氨酸S180G/Y215S。

本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供獲得所述角蛋白酶突變體的方法，具體步驟如下：

(1)根據(jù)從嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1中獲得編碼角蛋白酶KerSMD基因，克隆到pET22b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b+kerSMD；

(2)采用滾環(huán)PCR的方法，設(shè)計(jì)中間含有突變氨基酸代表的密碼子堿基的互補(bǔ)引物，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pET22b+kerSMD得到含有編碼角蛋白酶突變體的基因序列的開(kāi)環(huán)重組載體；

(3)將含有編碼正確突變體的基因的PCR反應(yīng)液經(jīng)過(guò)DpnI內(nèi)切酶消化，除去未突變的原來(lái)質(zhì)粒，反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，挑取正確復(fù)制子，并提取正確突變質(zhì)粒；

(4)將正確的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵上清液即角蛋白酶突變體粗酶液。