[發明專利]一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201710845163.3
• 申請日: 2015-03-18
• 公開（公告）號: CN107475228B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 張娟;方真;堵國成;陳堅;劉柏宏
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N15/57;C12N15/70;C11D3/386;D06M16/00;A23K20/189
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種角蛋白酶突變體，其特征在于，是將來源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的第215位的酪氨酸替換成甘氨酸；所述來源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.編碼權利要求1所述角蛋白酶突變體的基因。

3.攜帶權利要求2所述基因的載體或重組細胞。

4.一種獲得權利要求1所述角蛋白酶突變體的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)將從嗜麥芽窄食單胞菌BBE11-1中獲得的編碼角蛋白酶的基因，克隆到pET22b(+)中，構建重組質粒pET22b+kerSMD；

(2)采用滾環PCR的方法，設計含有代表突變氨基酸的密碼子堿基的互補引物，PCR擴增質粒pET22b+kerSMD得到含有編碼角蛋白酶突變體的基因序列的開環重組載體；

(3)將含有編碼正確突變體的基因的PCR反應液經過DpnI內切酶消化，除去未突變的原質粒，反應液直接轉化感受態大腸桿菌JM109，挑取正確復制子，并提取正確突變質粒；

(4)將正確的重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導表達，發酵上清液即角蛋白酶突變體粗酶液；

所述嗜麥芽窄食單胞菌BBE11-1的保藏編號為CCTCC No：M 2011193。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，還進一步包括使用AKTA蛋白純化儀和HisTrap FF crude 1ml的鎳柱對角蛋白酶進行純化。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，將步驟(4)獲得的重組菌在含有100μg/L的氨芐青霉素的LB培養基中37℃液體培養過夜，后接入含有100μg/L的氨芐青霉素的LB發酵液體培養基37℃培養至OD₆₀₀＝0.6，降溫至20℃培養，加入最終濃度0.1mM的誘導劑IPTG誘導，72h時離心獲得上清酶液，即為粗酶液。

7.權利要求1所述角蛋白酶突變體在制備日化洗滌產品中的應用。

8.權利要求1所述角蛋白酶突變體在紡織領域的應用。

9.權利要求1所述角蛋白酶突變體在制備飼料添加劑中的應用。