[發(fā)明專利]小鼠Shank 3基因cRNA探針及原位雜交顯色方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710842902.3
• 申請(qǐng)日: 2017-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107574228B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳晶;郭保霖;蔡國(guó)洪;吳菲菲;武勝昔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6841
• 分類號(hào): C12Q1/6841;C12Q1/6804;C12Q1/6883
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發(fā)明提供一種小鼠Shank 3基因cRNA探針及原位雜交顯色方法：該cRNA探針包括與小鼠Shank 3基因mRNA參考序列NM_021423.3的3445?4128位互補(bǔ)的核苷酸序列。將小鼠腦組織標(biāo)本置于雜交液中；雜交完成后漂洗、封閉，與抗體結(jié)合；然后利用TSA?biotin放大處理后進(jìn)行熒光顯色。本發(fā)明提出的cRNA探針針對(duì)Shank 3基因的特異性高，在不同個(gè)體的腦組織中均可以高效完成Shank 3基因的識(shí)別，可確保小鼠Shank 3基因原位雜交顯色的特異性和高效性，顯色效果更好，可與其他雜交或免疫熒光染色結(jié)合使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種Shank 3基因cRNA探針及其熒光原位雜交顯色方法。

背景技術(shù)

Shank家族是一類新發(fā)現(xiàn)的支架蛋白，其可通過(guò)不同的結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白相互作用，發(fā)揮多種作用。研究表明其中的Shank3基因與自閉癥的發(fā)病密切相關(guān)，Shank3基因的突變可導(dǎo)致自閉癥樣行為的出現(xiàn)。蛋白相互作用等研究表明Shank3蛋白可能通過(guò)不同結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)多種蛋白相互作用，最終影響細(xì)胞骨架和突觸的結(jié)構(gòu)與功能等。但關(guān)于這方面的形態(tài)學(xué)證據(jù)明顯不足，主要受限于目前商品化的抗體均不能清晰顯示Shank3蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位。

基于cRNA探針的原位雜交顯色方法在基因功能研究領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用，例如中國(guó)專利CN102559904A、CN106916886A。但是，篩選針對(duì)Shank家族，特別是Shank3基因的兼具雜交特異性和顯色靈敏性的cRNA探針還是領(lǐng)域內(nèi)的難題。盡管利用具有放大顯色效果功能的試劑進(jìn)行處理，更利于顯色，但是，目前尚未見(jiàn)到適合于Shank家族，特別是Shank3的cRNA探針原位雜交顯色用放大體系，這也是導(dǎo)致相應(yīng)的cRNA探針一直未能獲得的一個(gè)重要原因。此外，現(xiàn)有基于cRNA探針的顯色方法存在顯色試劑(例如放大用試劑，雜交液)組成復(fù)雜等不足之處，同時(shí)，顯色效果仍有待提高。

目前尚未見(jiàn)到針對(duì)Shank3基因的cRNA探針及熒光原位雜交顯色方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠Shank 3基因cRNA探針及原位雜交顯色方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種小鼠Shank 3基因cRNA探針，該cRNA探針的序列如SEQ.ID.NO.3所示(盡管實(shí)際探針為該序列中T替換為U后的RNA序列，但是本領(lǐng)域通常以對(duì)應(yīng)的U替換為T后的DNA形式表示cRNA，包括mRNA的參考序列也是如此)。

優(yōu)選的，所述cRNA探針是以小鼠腦組織cDNA為模板，并使用以下引物擴(kuò)增得到的：

上游引物：5’-ACCCGAGACTCTGAGAGAGG-3’；

下游引物：5’-AATGGTGCTTGTGGTCTCCA-3’。

優(yōu)選的，所述cRNA探針上標(biāo)記有地高辛。

一種小鼠Shank 3基因原位雜交顯色方法，包括以下步驟：

1)制備用于原位雜交的小鼠腦組織標(biāo)本(例如冰凍切片)；

2)將小鼠腦組織標(biāo)本依次經(jīng)過(guò)雜交前處理、雜交預(yù)處理后置于雜交液中進(jìn)行原位雜交；所述原位雜交中采用的雜交液由雜交預(yù)處理中使用的預(yù)雜交液和小鼠Shank 3基因cRNA探針組成，所述cRNA探針包括與小鼠Shank 3基因mRNA參考序列NM_021423.3的3445-4128位互補(bǔ)的核苷酸序列，或者包括該核苷酸序列的同源序列；該cRNA探針上標(biāo)記有地高辛；