[發明專利]瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201710842039.1
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN109517911B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 曾蓉;戴富明;高士剛;徐麗慧;劉欣;張佳婧
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 崔兆慧;費開逵

1.瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測引物，其特征在于，所述雙重PCR檢測引物包括瓜類細菌性果斑病菌檢測引物對AC12M-534和瓜類細菌性葉斑病菌檢測引物對PsH-254，其中，

引物對AC12M-534包括引物AC12M-534F和引物AC12M-534R，具體核苷酸序列如下：

引物AC12M-534F：5'-CGATGCCTATGCCCGTTTCT-3'；

引物AC12M-534R：5'-TCCGCGATCCAGCCTTCTT-3'；

引物對PsH-254包括引物PsH-254F和引物PsH-254R，具體核苷酸序列如下：

引物PsH-254F：5'-ATGAACACTAAATACRCTCGTACG-3'；

引物PsH-254R：5'-TACTGTARCGCGGTAAAACCG-3'。

2.根據權利要求1所述瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測引物，其特征在于，所述瓜類細菌性果斑病菌檢測引物對AC12M-534的擴增產物大小為534bp，所述瓜類細菌性葉斑病菌檢測引物對PsH-254的擴增產物大小為254bp。

3.一種瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測試劑盒，其包括權利要求1所述的雙重PCR檢測引物。

4.如權利要求1所述的瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測引物在同時檢測瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌中的應用。

5.如權利要求1所述的瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測引物在制備同時檢測瓜類細菌性果斑病菌與葉斑病菌的檢測試劑盒中的應用。

6.一種利用權利要求1或2所述的雙重PCR檢測引物進行雙重PCR檢測的方法，包括以下步驟：

1)采集有癥狀的葉片，在病葉組織中加入無菌水，充分研磨，得到待測樣品研磨汁液；

2)以待測樣品DNA或待測樣品研磨汁液為模板、利用權利要求1中所述的引物AC12M-534F、引物AC12M-534R、引物PsH-254F、引物PsH-254R進行雙重PCR擴增；

3)擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測及判斷

PCR反應終止后，取PCR產物，用1％瓊脂糖電泳檢測擴增結果：擴增得到534bp大小產物則判定為待測樣品中檢測出瓜類細菌性果斑病菌，擴增得到254bp大小產物則判定為待測樣品中檢測出細菌性葉斑病菌。

7.根據權利要求6所述的雙重PCR檢測的方法，其特征在于，步驟1)中，所述待測樣品為植物葉片或果實。

8.根據權利要求6所述的雙重PCR檢測的方法，其特征在于，步驟2)中，所述雙重PCR擴增的PCR反應體系為：Taq Master Mix 10.0μL，10μM引物AC12M-534F、10μM引物AC12M-534R、10μM引物PsH-254F和10μM引物PsH-254R各0.5μL，模板1.0μL，無菌去離子水補足至20.0μL；

PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性20s，54-61.3℃退火20s，72℃延伸30s，運行30個循環；72℃延伸5min。