[發(fā)明專(zhuān)利]瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710842039.1
• 申請(qǐng)日: 2017-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109517911B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾蓉;戴富明;高士剛;徐麗慧;劉欣;張佳婧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 上海開(kāi)祺知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 崔兆慧;費(fèi)開(kāi)逵

瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，其根據(jù)這兩種病害的病原菌各自特有的基因序列，設(shè)計(jì)出特異性引物對(duì)AC12M?534和PsH?254，建立了瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌與瓜類(lèi)細(xì)菌性葉斑病菌的雙重PCR快速檢測(cè)方法。待測(cè)樣品經(jīng)雙重PCR擴(kuò)增，在1％凝膠電泳圖中出現(xiàn)534bp的特異性片段表明待測(cè)樣品攜帶瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌；出現(xiàn)254bp的特異性片段表明樣品攜帶瓜類(lèi)細(xì)菌性葉斑病菌。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)一次性PCR擴(kuò)增就能對(duì)瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病與葉斑病樣品進(jìn)行鑒別與診斷，從而迅速區(qū)分檢疫性細(xì)菌病害與普通細(xì)菌性病害，具有快速、特異、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于科學(xué)防控這兩種細(xì)菌性病害具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌與葉斑 病菌的雙重PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病(Bacterial fruit blotch，BFB)的病原為西瓜嗜酸 菌(Acidovorax citrulli)(簡(jiǎn)稱(chēng)A.citrulli)，是西甜瓜等葫蘆科作物上重 要的細(xì)菌性病害，是一種重要的檢疫性病害。該病害是一種典型的種傳病 害，能導(dǎo)致作物的葉片、果實(shí)和種子帶病，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和質(zhì)量， 甚至帶來(lái)毀滅性災(zāi)害。上世紀(jì)90年代，首次在我國(guó)報(bào)道發(fā)生，隨后新疆、 海南等多地有報(bào)道發(fā)生。

瓜類(lèi)細(xì)菌性葉斑病的病原為丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)(簡(jiǎn) 稱(chēng)P.syringae)，也是西甜瓜上一種重要的細(xì)菌性病害，或被稱(chēng)為葉枯病， 屬于非檢疫性病害。李亞利等2004年，在甘肅、新疆等發(fā)現(xiàn)的與果斑病 癥狀非常類(lèi)似的細(xì)菌性病害，發(fā)生率為30-100％，后檢測(cè)出引起病害的病 原是P.syringae pv.lacharymans(SmithBryan1915)。

這兩種病害在西甜瓜生產(chǎn)的苗期、成株期、掛果期及收獲期均能引起 病害，嚴(yán)重威脅葫蘆科產(chǎn)業(yè)發(fā)展，且兩種病害引起的病害癥狀十分相似， 肉眼難于辨別，亟待尋找一種快速、簡(jiǎn)便方法來(lái)區(qū)分這兩種細(xì)菌性病害。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR 檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)一次性PCR擴(kuò)增就能對(duì)田間癥狀易混淆的瓜 類(lèi)細(xì)菌性果斑病與葉斑病樣品進(jìn)行鑒別與診斷，且該檢測(cè)方法具有快速、 簡(jiǎn)便、高效、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

本發(fā)明利用生物信息學(xué)方法在瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌與葉斑病菌各自 的全基因組中尋找特異基因，根據(jù)特異核苷酸序列設(shè)計(jì)了這兩種病害特異 性的雙重PCR檢測(cè)引物，建立了這兩種病害的可靠的雙重PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明所述瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌與葉斑病菌的雙重PCR檢測(cè)引物， 其包括瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌檢測(cè)引物對(duì)AC12M-534和瓜類(lèi)細(xì)菌性葉斑病 菌檢測(cè)引物對(duì)PsH-254，其中，引物對(duì)AC12M-534包括引物AC12M-534F 和引物AC12M-534R，具體核苷酸序列如下：

引物AC12M-534F：5'-CGATGCCTATGCCCGTTTCT-3'；

引物AC12M-534R：5'-TCCGCGATCCAGCCTTCTT-3'；

引物對(duì)PsH-254包括引物PsH-254F和引物PsH-254R，具體核苷酸 序列如下：

引物PsH-254F：5'-ATGAACACTAAATACRCTCGTACG-3'；

引物PsH-254R：5'-TACTGTARCGCGGTAAAACCG-3'。

進(jìn)一步，所述瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌檢測(cè)引物對(duì)AC12M-534的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物大小為534bp，所述瓜類(lèi)細(xì)菌性葉斑病菌檢測(cè)引物對(duì)PsH-254的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物大小為254bp。