[發明專利]一種用于牦牛親子鑒定和個體識別的基因分型檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201710841911.0
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN107760789B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 裴杰;郭憲;褚敏;包鵬甲;梁春年;丁學智;王宏博;吳曉云;閻萍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 姜司晨

本發明公開了用于牦牛親子鑒定和個體識別的STR標記檢測系統基因分型的復合PCR擴增系統和檢測試劑盒，所述引物帶有熒光標記，可以擴增牦牛14個STR標記位點，這些標記多態性高、標記間不連鎖、片段大小適當；所述STR檢測系統通過所述14對引物的擴增和電泳檢測，獲得14個STR位點的基因分型結果；根據STR的分型結果和牦牛各STR的基因頻率對牦牛進行親子鑒定和個體識別。本發明的方案通過綜合分析STR基因座分型結果能有效的進行牦牛的親子鑒定和個體識別，進而可提高牦牛育種工作中系譜的準確性，加快育種進程，具有良好的應用前景和經濟價值。

技術領域

本發明涉及動物核酸體外檢測技術領域，具體涉及用于牦牛親子鑒定和個體識別的STR標記檢測系統基因分型的復合PCR擴增系統和檢測試劑盒。

背景技術

系譜信息在牦牛育種中起著重要的作用。錯誤的系譜會大大降低遺傳評定的準確性，影響選種選配的效果，降低群體的遺傳進展，給牦牛產業帶來巨大經濟損失。然而，在實際養殖生產中，系譜記錄錯誤是難免的，它受多種因素影響，如配種記錄、產犢記錄、系譜錄入及整理中的人為錯誤，尤其在飼養粗放的散養式放牧狀態下，犢牛出生后很難確定其父親，甚至母親。

短串聯重復序列(Short Tandem Repeat,STR)，是廣泛存在于生物基因組中的一類具有高度多態性的遺傳學標記。由于其具有片段小、易擴增、靈敏性好、準確度高、檢測速度快、信息含量大，適宜于微量或降解樣品檢測，各基因座的擴增條件相似而能夠實現復合擴增等特點，將STR復合擴增技術應用于動物的親子鑒定和個體識別方面具有極大的優越性。

在普通牛上，將STR標記應用于親子鑒定的報道較多，而尚未見應用STR標記技術對牦牛進行親子鑒定的報道。關于牦牛STR標記的研究只限于群體結構和進化分析，并且所用的引物都直接取自文獻報道中普通牛的引物序列，如徐公瑾(2004年)從FAO指定的30個普通牛的STR標記中選擇出26個標記用于天祝白牦牛的聚類分析；李齊發(2004年)利用鏈親和素磁珠親和捕獲的方法構建了牦牛基因組STR富集文庫，并通過20個重復次數較多的STR標記對牦牛進行了分子進化分析；曾玉峰(2013年)利用15個STR位點標記信息對6個牦牛品種進行了遺傳多樣性和進化樹分析；趙芳芳(2015年)通過對野牦牛部分基因組序列進行STR序列搜索，找到43409個STR位點，并且利用其中的77個STR位點對麥洼牦牛進行群體遺傳分化特征分析。

雖然利用部分普通牛的STR標記引物可以對牦牛的相應位點進行擴增，但是畢竟牦牛與普通牛在基因序列上存在一定的差異，直接利用普通牛的引物往往達不到對牦牛STR位點檢測的最佳效果。本發明選擇多態性較高且不存在連鎖關系的36個普通牛的STR位點，在牦牛基因組上找到相應的DNA序列，對文獻中引物和牦牛基因組序列進行分析，選擇可以直接應用于牦牛STR擴增的引物，其他STR位點則重新設計引物；另外，在牦牛基因組上找到4個新的STR位點，設計合適的引物；對以上40個引物進行合成，以牦牛基因組DNA為模板對所選的40個STR標記位點進行擴增，挑選到21個條帶清晰、得率較高、特異性好的引物；對這21個引物進行熒光引物合成，對牦牛基因組DNA混合池進行擴增，挑選熒光信號強、好判型、雜合度高、多態信息含量豐富的14個STR位點。最終，確定普通牛BM2113和ILSTS008位點的引物可直接用于牦牛相應STR的擴增；針對11個STR位點(BM720、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07、YAK08)設計的新引物可用于牦牛STR檢測；在牦牛的基因組上找到一個新的STR位點CH28AC，可用于牦牛該位點的檢測。

對所設計的引物進行組合和擴增條件摸索。多重PCR的不同引物進行組合主要根據以下一些原則：盡可能避免各引物間的互補結構、發夾結構等一結和二級構象；要求退火溫度盡可能接近；考慮不同引物的擴增片段長度和熒光標記顏色；每種引物在選定的退火溫度梯度范圍內作PCR反應時能得到有效擴增。最終，確定了本發明中的STR擴增引物和檢測系統。

發明內容