[發(fā)明專利]超厚組織切片的制備及細(xì)胞水平再現(xiàn)組織三維形態(tài)結(jié)構(gòu)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710841373.5
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN107727463B
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪艷;鄭永見;潘明新;李陽
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N1/34;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京市立方律師事務(wù)所 11330
• 代理人: 劉延喜;王增鑫

本發(fā)明公開一種超厚組織切片的制備方法，其包括以下步驟：獲取待觀察的組織材料；制備所述組織材料1～8mm的組織切片并對該組織切片進(jìn)行透明化；對透明化的所述組織切片進(jìn)行熒光染色。其次是一種組織切片三維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的再現(xiàn)方法，其包括以下步驟：制備厚度為1～8mm的透明化組織切片；利用熒光顯微鏡獲取組織切片的圖像數(shù)據(jù)；重組所述圖像數(shù)據(jù)以形成三維模型數(shù)據(jù)；基于所述三維模型數(shù)據(jù)輸出三維圖像。本發(fā)明超厚組織切片的制備方法及三維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)再現(xiàn)的方法，對組織切片進(jìn)行除脂達(dá)到透明以增加激光穿透肝組織的深度，減少光散射，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組織的深度成像，以更真實(shí)的狀態(tài)反映組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)提高了成像的效率和保真度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物組織顯微觀察領(lǐng)域，尤其涉及一種超厚組織切片的制備及細(xì)胞水平再現(xiàn)組織三維形態(tài)結(jié)構(gòu)的方法。

背景技術(shù)

在對器官或組織的細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)信息分析時(shí)，3-10μm的2D組織切片是實(shí)現(xiàn)該要求的常規(guī)方法。通常是將器官/組織固定后經(jīng)石蠟包埋后切片(或冰凍切片)，然后進(jìn)行相應(yīng)的染色后在顯微鏡下觀察，該方法可以對器官/組織內(nèi)的各種細(xì)胞類型及其分布進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。但這種方法僅局限于某一平面水平并不一定能將器官/組織的整體包含在內(nèi)，特別在對器官進(jìn)行病理分析時(shí)，以肝臟為例，現(xiàn)有技術(shù)不能將肝臟病變部位包含在一個組織切片或若干連續(xù)的組織切片內(nèi)，且許多肝臟疾病，例如肝癌其病灶與周圍的結(jié)構(gòu)(血管、神經(jīng)、淋巴管等)的空間分布有著非常密切的聯(lián)系，如果能夠在保證組織完整的前提下從細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平觀察這些病變，將對肝臟疾病甚至其他疾病的研究有重大貢獻(xiàn)。對肝臟及其他器官進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)觀察時(shí)，CT、MRI以及PET等影像手段擁有出色的組織成像深度，還具備越來越好的細(xì)節(jié)分辨能力，但這些影像學(xué)設(shè)備最高的分辨率(0.5-2.0mm)目前無法使成像效果達(dá)到細(xì)胞水平。

為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，現(xiàn)有技術(shù)之一，采用連續(xù)性切片染色經(jīng)顯微鏡觀察獲取圖片后，利用計(jì)算機(jī)軟件對圖像進(jìn)行拼接，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平的肝臟組織三維結(jié)構(gòu)的觀察。為了觀察肝內(nèi)膽管的形態(tài)結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，研究者通過對取材的肝臟進(jìn)行10μm厚度的連續(xù)性冰凍切片，膽管上皮細(xì)胞表面特異性抗原染色(CK19)，然后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡獲取圖片后，將42-70張2D圖片經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行拼接(Z軸接近500μm)，從而得到了可用于觀察和分析的3D結(jié)構(gòu)的肝內(nèi)膽管樹圖像。肝組織連續(xù)性機(jī)械切片結(jié)合3D圖像重建技術(shù)，可以提供肝臟的全部圖像，但從嚴(yán)格意義上說，基于這種3D圖像重建技術(shù)形成的全肝圖像是虛擬的，并不能完全代替真實(shí)的器官結(jié)構(gòu)，且整個過程需要耗費(fèi)大量的時(shí)間精力進(jìn)行圖像處理。

現(xiàn)有技術(shù)之二，采用100μm的厚組織切片(此厚度為顯微鏡掃描深度極限)進(jìn)行相應(yīng)的、染色顯微鏡觀察后，將獲取的圖片利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析重建，得到了肝血竇和膽小管的結(jié)構(gòu)分布情況3D結(jié)構(gòu)圖像。利用厚組織切片(100μm)獲取肝臟的3D結(jié)構(gòu)圖像，其局限在于受激光穿透深度、抗體的滲透限制，觀察厚度≤100μm，因此Z軸的成像深度仍然小于單個肝小葉的直徑，并不能達(dá)到理想的觀察深度。

如何對各類細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的進(jìn)行理想深度的三維結(jié)構(gòu)觀察是人們現(xiàn)階段對各種器官尤其是肝臟形態(tài)學(xué)研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，提供一種可以至少部分解決現(xiàn)有技術(shù)缺陷的細(xì)胞水平再現(xiàn)組織三維形態(tài)結(jié)構(gòu)的方法，以及適用于該方法的超厚組織切片的制備方法。

為達(dá)到以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

首先是一種超厚組織切片的制備方法，其包括以下步驟：

獲取待觀察的組織材料；

制備所述組織材料1～8mm的組織切片并對該組織切片進(jìn)行透明化；

對透明化的所述組織切片進(jìn)行熒光染色。

進(jìn)一步地，所述組織材料在制備組織切片之前進(jìn)行以下至少一項(xiàng)預(yù)處理：

對所述組織材料進(jìn)行表面清洗；