[發明專利]超厚組織切片的制備及細胞水平再現組織三維形態結構的方法

有效

• 申請號: 201710841373.5
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN107727463B
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 汪艷;鄭永見;潘明新;李陽
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學珠江醫院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N1/34;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京市立方律師事務所 11330
• 代理人: 劉延喜;王增鑫

1.一種超厚組織切片的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟：

獲取待觀察的組織材料，所述組織材料為采用冷凍振蕩切片法獲得的肝臟組織切片；

制備所述組織材料1～8mm的組織切片，所述組織切片與水凝膠溶液孵育形成組織-水凝膠復合物，在37℃的條件下，將組織-水凝膠復合物浸泡在透明液中進行振動洗脫，所述透明液每隔預定的時間更換一次，直至所述組織-水凝膠復合物變透明，以實現所述組織切片的透明化，以對該組織切片進行透明化；

對透明化的所述組織切片進行熒光染色；

其中，所述組織切片與水凝膠溶液孵育形成組織-水凝膠復合物的在步驟包括：在4℃的條件下將所述組織切片浸泡在所述水凝膠溶液中孵育2d，孵育后對水溶膠溶液中的組織切片在13.3kPa的條件下抽真空10～15min，在37℃的條件下繼續以13.3kPa的壓強抽真空2～3h，以促進發生組織和水凝膠之間的聚合反應。

2.如權利要求1所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述組織材料在制備組織切片之前進行以下至少一項預處理：

對所述組織材料進行表面清洗；

對所述組織材料進行內部的去血處理；

對所述組織材料進行化學固定。

3.如權利要求2所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述肝臟在制備成組織切片之前，采用穿刺灌注法對所述肝臟依次進行去血處理和化學固定處理。

4.如權利要求3所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述去血處理過程使用肝素化的磷酸緩沖液作為灌注液；所述化學固定處理過程使用4％的多聚甲醛作為灌注液。

5.如權利要求4所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，以質量體積比計算，所述水凝膠溶液包括溶解在磷酸緩沖液中的4％的丙烯酰胺和0.25％引發劑。

6.如權利要求5所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述引發劑選自二鹽酸化物。

7.如權利要求6所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述引發劑選自偶氮二咪唑啉基丙烷。

8.如權利要求7所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述透明液為8％質量體積比的十二烷基硫酸鈉溶液。

9.如權利要求8所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述預定的時間為3d。

10.如權利要求1所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述熒光染色采用免疫熒光染色法實現。

11.如權利要求10所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述免疫熒光染色法包括依次用一抗和二抗進行孵育的過程，所述一抗和二抗的孵育時間分別為3～7d。

12.如權利要求1或11所述的超厚組織切片的制備方法，其特征在于，所述組織切片進行熒光染色之后，在80％體積比的甘油水溶液中保存備用。

13.一種細胞水平再現組織三維形態結構的方法，其特征在于，包括以下步驟：

制備厚度為1～8mm的透明化組織切片，所述透明化組織切片采用如權利要求1～12任意一項所述的超厚組織切片的制備方法獲得；

利用熒光顯微鏡獲取組織切片的圖像數據；

重組所述圖像數據以形成三維模型數據；

基于所述三維模型數據輸出三維圖像。

14.如權利要求13所述的細胞水平再現組織三維形態結構的方法，其特征在于，在進行熒光顯微鏡觀察之前對所述組織切片進行封片，封片的具體步驟為：在載玻片上用藍丁膠堆棧供所述組織切片置入的孔槽；將所述組織切片置入所述孔槽之后用80％的甘油填充；加蓋蓋玻片，以備觀察。