[發(fā)明專利]一種用于眼表刺激性評(píng)價(jià)的重組角膜模型及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710841289.3
• 申請(qǐng)日: 2018-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN110066847A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李瀟;盧永波;鄧志宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02;C12N5/074;A61L27/38;A61L27/50;A61F2/14
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一種用于眼表刺激性評(píng)價(jià)的重組角膜模型及其制備方法，具體涉及體外器官培養(yǎng)與組織再生領(lǐng)域。本發(fā)明從種子細(xì)胞角度出發(fā)，通過體外富集和擴(kuò)增角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行三維角膜上皮模型的構(gòu)建，既實(shí)現(xiàn)了種子細(xì)胞為角膜系，保證了眼刺激評(píng)價(jià)的體外體內(nèi)一致性，也解決了產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)問題，有利于眼表刺激體外替代實(shí)驗(yàn)的推行。

技術(shù)領(lǐng)域

一種用于眼表刺激性評(píng)價(jià)的重組角膜模型及其制備方法，具體涉及體外器官培養(yǎng)與組織再生領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)，隨著體外器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，基于體外細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的3D重組角膜模型，在臨床替代損傷角膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)行眼角膜損傷性修復(fù)的治療方面具有顯著功效。但由于其臨床目應(yīng)用主要是替代角膜損傷組織進(jìn)行進(jìn)行移植，多以開放式片狀形式生產(chǎn)，并且是生物材料和不同類型種子細(xì)胞體外復(fù)合形成的三維空間復(fù)合體，因此整個(gè)角膜組織的結(jié)構(gòu)及通透性方面都發(fā)生了改變，而化學(xué)品眼刺激性評(píng)價(jià)需要模仿化學(xué)品在眼表的滲透過程，要求在邊緣無(wú)滲漏的密閉體系下進(jìn)行，且應(yīng)用于評(píng)價(jià)的重組角膜模型需要形成緊密的細(xì)胞連接才能體外模仿化學(xué)品在人體眼表的滲透特性，而給出準(zhǔn)確的刺激性評(píng)價(jià)結(jié)果。因此，當(dāng)前臨床上應(yīng)用的重組角膜無(wú)法進(jìn)行化學(xué)品的眼刺激性體外替代評(píng)價(jià)。

基于以上背景，建立和開發(fā)類似于人體角膜上皮的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)，不僅可以更為真實(shí)的反映人體對(duì)化學(xué)物的響應(yīng)，準(zhǔn)確給出化學(xué)物刺激性的預(yù)測(cè)，對(duì)于化合物篩選的種類也具有更寬的應(yīng)用范疇，除了不同功效目的的劑型開發(fā)，也包括化妝品具體成分的危害評(píng)價(jià)。目前，國(guó)際上針對(duì)化學(xué)品眼刺激性評(píng)價(jià)的體外重組角膜上皮模型主要有三種商業(yè)化的產(chǎn)品， EpiOcular? (MatTek, MA, USA)， HCE (Skin Ethic ,France)以及CORNEA-MODEL（Labcyte，Japen）。其中EpiOcularTM以人源的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞作為種子細(xì)胞，體外培養(yǎng)形成類似于角膜上皮結(jié)構(gòu)的模型。HCE模型采用永生化的角膜上皮細(xì)胞系作為種子細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)形成的多細(xì)胞層的角膜上皮組織類似物，結(jié)構(gòu)上和角膜黏膜非常類似。雖然兩款模型在眼刺激性動(dòng)物替代評(píng)價(jià)方法中扮演重要的角色，但是EpiOcular的非角膜細(xì)胞系和HCE模型的永生化細(xì)胞系并不能完全意義上等同于人角膜，因此，對(duì)于體外模擬化學(xué)物對(duì)角膜刺激性的精確復(fù)制還有待考量。Labcyte CORNEA-MODEL采用正常的人角膜上皮細(xì)胞系進(jìn)行構(gòu)建，體外培養(yǎng)形成角膜上皮結(jié)構(gòu)。角膜上皮細(xì)胞是體外研究細(xì)胞分化，信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)信號(hào)通路的模式工具，也可以用來(lái)進(jìn)行體外三維的角膜上皮組織模型，但是可用角膜組織的有限來(lái)源，角膜細(xì)胞自身短暫的生命周期以及快速的分化使得角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)難度大，且非常耗時(shí)。因此，采用角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行三維角膜模型的體外構(gòu)建如果不解決種子細(xì)胞自身的問題，將僅限于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，而無(wú)法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，許多嘗試增長(zhǎng)角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期的工作都有開展，例如病毒轉(zhuǎn)染，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)染等，但是這些永生化的細(xì)胞系因?yàn)槠洚惓５幕虮硇秃椭铝龅臐撛陲L(fēng)險(xiǎn)而無(wú)法應(yīng)用于生物學(xué)中角膜模型的構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明從種子細(xì)胞角度出發(fā)，通過體外富集和擴(kuò)增角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行三維角膜上皮模型的構(gòu)建，既實(shí)現(xiàn)了種子細(xì)胞為角膜系，保證了眼刺激評(píng)價(jià)的體外體內(nèi)一致性，也解決了產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)問題，有利于眼表刺激體外替代實(shí)驗(yàn)的推行。因此，本發(fā)明旨在提供一種可在體外模擬實(shí)現(xiàn)角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增及用其構(gòu)建三維角膜上皮模型的方法。此外本發(fā)明也提供一種可用于體外模擬角膜緣干細(xì)胞微環(huán)境的角膜基質(zhì)微粒的制備方法。

解決上述問題，采用的技術(shù)方案如下：

一、制備脫細(xì)胞角膜基質(zhì)

選取包含有前彈力層的動(dòng)物源性角膜，將其置于添加抗生素的、溫度在2～30℃的去離子水中浸泡，對(duì)其進(jìn)行脫細(xì)胞處理，具體方法可參考專利CN 104971384 A中的方法。將獲取的脫細(xì)胞動(dòng)物源性的角膜材料置于削切機(jī)中，切削獲取角膜基質(zhì)層。并對(duì)角膜基質(zhì)層進(jìn)行去抗原、病毒滅活處理。

二、 制備角膜基質(zhì)微載體