[發明專利]一種用于眼表刺激性評價的重組角膜模型及其制備方法

在審

• 申請號: 201710841289.3
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN110066847A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 李瀟;盧永波;鄧志宏
• 申請（專利權）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/074;A61L27/38;A61L27/50;A61F2/14
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1.一種用于眼表刺激性評價的重組角膜模型，其特征在于：含有4～6層角膜上皮細胞，采用角膜緣干細胞又不僅限于角膜緣干細胞的角膜系上皮細胞為種子細胞。

2.一種用于眼表刺激性評價的重組角膜模型的制備方法，其特征在于：采用角膜基質層制備基質微粒，結合旋轉培養體系體外模擬角膜緣干細胞生長微環境擴增角膜。

3.根據權利要求2所述的一種用于眼表刺激性評價的重組角膜模型的制備方法，其特征在于，采用角膜緣干細胞作為種子細胞，制備角膜上皮細胞體外培養的條件培養基，通過不同的條件培養基誘導角膜緣干細胞體外增殖和分化。

4.根據權利要求3所述的一種用于眼表刺激性評價的重組角膜模型的制備方法，其特征在于，具體方法步驟如下：

1)制備角膜緣干細胞

將來自于眼庫的眼球采用含質量分數為1%的慶大霉素的生理鹽水浸泡30分鐘，將角膜沿角膜緣剪下，得到角膜緣組織；

用D-Hank’s 液漂洗角膜緣組織兩只三次；

將清洗好的角膜緣組織剪成2mm見方的組織塊，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化5～8分鐘，采用含有10%胎牛血清的DMED終止消化；

離心，收集細胞；

采用DMEM進行細胞重懸，制成1E4～2E4/ml的角膜緣干細胞細胞懸液，備用；

2)體外培養、擴增角膜緣干細胞

取上述角膜緣干細胞細胞懸液10ml與步驟二中制備的角膜基質微載體200mg注入容量為30ml的旋轉培養系統，轉速設定為20～30轉/分鐘，每天采用新鮮的DMEM進行換液，培養至細胞融合度為80%，排干細胞培養液，采用磷酸鹽緩沖液清晰一至兩遍后，棄去緩沖液，加入0.25%的胰蛋白酶，調整轉速至50～70轉/分鐘，旋轉5～10分鐘進行細胞收集和獲取，完成角膜緣干細胞的體外擴增；

3）構建體外重角膜上皮模型

3.1）將步驟三中獲得的角膜緣干細胞采用培養液SK1進行重懸，接種于底面積為0.5cm2的細胞小室中，接種密度為0.2×105～0.5×105個/ cm2，保持該細胞小室內的液量為150～200μl，在5% CO2、36～37℃的細胞培養箱中孵育24～48小時；

本步驟也可以采用角膜緣干細胞和角膜上皮細胞按照1:1或者大于1:1的比例混合進行；

所述構建培養液SKc1是在DMEM培養液中添加體積比分別為5～10%的胎牛血清FBS，0.1～0.5ng/ml 的EGF，0.1～0.8 μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰島素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3,4～10μg/ml的維甲酸；

3.2）培養2～3d后，更換成構建培養液SK2，并進行氣液面培養，將步驟4.1）中細胞小室內的培養液吸去，保持構建模型面表的干燥，隨后在4.5%～5.5% CO2、37±1℃的孵箱中培養2～3d，每天換液一次；所述構建培養液SK2是在DMEM培養液中添加體積比分別為5～10%的胎牛血清FBS，添加0.25～0.5 mM的CaCl2，0.1～0. 5 ng/ml 的EGF，25～75μg/ml的Vc，0.1～0.8 μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰島素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的維甲酸；

3.3）2～3d后，更換成構建培養液SK3，并進行氣液面培養，在4.5%～5.5% CO2、37±1℃的孵箱中培養2～3d，每天換液一次；所述構建培養液SK3是在DMEM培養液中添加體積比分別為5～10%的胎牛血清FBS，添加0.5～1mM的CaCl2，0.1～0. 5 ng/ml 的EGF，25～75μg/ml的Vc，0.1～0.8μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰島素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0. 5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的維甲酸。