[發明專利]一種耐氧化低溫葡萄糖氧化酶及其生產方法與應用

有效

• 申請號: 201710838183.8
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN107488640B
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 王興吉;賈仁潔;錢娟娟;郭慶文;張杰
• 申請（專利權）人: 山東隆科特酶制劑有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N1/14;C12R1/685
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種低溫葡萄糖氧化酶及其生產方法與應用。所述葡萄糖氧化酶產自黑曲霉(Aspergillu niger)CH870，保藏編號為CGMCC No.14138。該菌株發酵生產的葡萄糖氧化酶的發酵液酶活達到2300U/ml以上，所生產的葡萄糖氧化酶在pH2.0?8.0范圍內穩定，最適反應溫度20℃，穩定性好，且具有耐氧化性，30mmol過氧化氫條件下，剩余酶活為100％；200mmol過氧化氫條件下，剩余酶活為90.8％，應用廣泛。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種耐氧化性提高的低溫葡萄糖氧化酶及其生產方法與應用。

背景技術：

葡萄糖氧化酶(GOD)能夠專一地將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫，葡萄糖氧化酶在食品、醫藥及生物等領域都有著廣泛的應用。

由于葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖消耗氧氣，產生葡萄糖酸和過氧化氫，所以它在食品行業中應用非常廣泛，主要表現在以下四個方面：去除食品中殘留的葡萄糖、脫氧、殺菌、測定食品中葡萄糖含量。

葡萄糖氧化酶作為新型的綠色酶制劑，在1999年被國家列為12種被允許使用的飼料添加劑之一。葡萄糖氧化酶促生長的作用機理是：在動物飼料中添加的葡萄糖氧化酶能具有抗氧化的功能，能夠清除掉牲畜應激狀態下在腸道上皮細胞產生的大量自由基，來保護腸道上皮細胞的完整性。

醫學上尿糖試紙用來測定糖尿病人尿液中的葡萄糖含量，原理是根據葡萄糖氧化酶酶促反應產生過氧化氫，過氧化氫被過氧化氫酶進一步分解可以產生水和氧，氧將試紙上的還原型并且無色鄰聯甲苯胺染料氧化為藍色物質，藍色物質生成量與葡萄糖濃度成比例，將試紙顏色的深淺與標準色板比較，判斷尿中葡萄糖的含量多少。葡萄糖氧化酶氧速率法測定葡萄糖的準確度高、線性范圍廣、反應特異性強、重復性良好。

目前國際上研制成功的酶傳感器有幾十種，Updike和Hicks于1967年首次將GOD膜覆蓋在鉑電極上從而制成酶傳感器，它用于定量的檢測血清中葡萄糖的含量，并且成功地制成了第一支葡萄糖生物傳感器。

葡萄糖氧化酶(GOD)廣泛分布于動物、植物及微生物體內。但由于在動植物體內含量較少，并且提取上有一定的局限性，故較少采用。

在微生物中，葡萄糖氧化酶的生產主要采用霉菌發酵法，一般采用曲霉和青霉做為生產菌種，如黑曲霉、米曲霉、青霉、乳酸克魯維酵母和脆壁克魯維酵母，是工業生產GOD的普遍酶原。目前，國內外均采用微生物發酵法生產葡萄糖氧化酶。由于霉菌在一定條件下產生葡萄糖氧化酶的能力強，因此，葡萄糖氧化酶的工業化生產主要采用黑曲霉(Aspergillu niger)和青霉菌(Penicilliunnotation)。但葡萄糖氧化酶幾乎全部依賴于進口，生產成本也隨之提高。因此，篩選性能優越的葡萄糖氧化酶酶，具有重大的實際應用價值。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明將提供一種耐氧化低溫葡萄糖氧化酶及其生產方法與應用。

所述葡萄糖氧化酶產自一株黑曲霉，所述黑曲霉是本實驗室經物理誘變和化學復合誘變后得到一株耐氧化性提高的高產低溫葡萄糖氧化酶菌株，經鑒定其屬于黑曲霉，具體為黑曲霉(Aspergillu niger)CH870，該菌株已于2017年7月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCC No.14138。

本發明還提供一種發酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的葡萄糖氧化酶的液態微生物發酵生產方法，具體如下：

以黑曲霉(Aspergillu niger)CH870為生產菌種；

(1)種子罐培養：