[發(fā)明專利]一種誘導桃兒七體細胞胚發(fā)生的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710837774.3
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107372126B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發(fā)明（設計）人: 郭生虎;李明;陳虞超;劉華;朱永興;關雅靜;石磊;安鈺
• 申請（專利權）人: 寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)生物技術研究中心;寧夏農(nóng)林科學院荒漠化治理研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明提供了一種誘導桃兒七體細胞胚發(fā)生的方法，涉及組織培養(yǎng)技術領域。包括以下操作步驟：(1)無菌試管苗的誘導；(2)胚性愈傷組織的分化；(3)體細胞胚的誘導；(4)體細胞胚的同步化調控及增殖培養(yǎng)，獲得大量桃兒七體細胞胚叢生芽。本發(fā)明提供的方法得到的體細胞胚叢生芽誘導率達75％以上，再生種苗存活率達85％以上。本發(fā)明提供的方法操作工藝簡單，不受時間、季節(jié)限制，可以在室內工廠化生產(chǎn)桃兒七體細胞胚再生種苗以供生產(chǎn)栽培需要。

技術領域

本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種桃兒七體細胞胚發(fā)生的方法。

背景技術

桃兒七Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying為小檗科桃兒七屬多年生草本植物，主要分布于東喜馬拉雅及臨近地區(qū)，是我國傳統(tǒng)名貴瀕危中藥材之一，主要用于痛癤腫毒、風濕性骨痛、氣管炎等癥，近年來研究發(fā)現(xiàn)其根和根狀莖中含有大量的具有抗癌活性的木脂素類化合物，其中鬼臼毒素抗癌活性最高，是合成GP7，VP16和VM-26等抗癌藥物的前體化合物，具有非常廣闊的應用前景。桃兒七藥材目前主要依賴于野生資源，隨需求量的日益增加，過度采挖使桃兒七資源日益減少，目前已被列入《中華珍稀瀕危植物名錄》，是國家三級瀕危中藥材。

寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)生物技術研究中心從2014年開始對桃兒七種苗繁育進行研究，發(fā)現(xiàn)桃兒七種子具有一定的休眠和后熟特性，自然條件下種子發(fā)芽率不到10％，，種子幼苗的生長對環(huán)境要求比較苛刻，無法滿足規(guī)?；斯ぴ耘嗟男枨?。植物體細胞胚胎發(fā)生技術是植物無性繁殖的重要途徑，通過組織培養(yǎng)，能夠提供繁殖數(shù)量大、繁殖速度快，后代遺傳穩(wěn)定的體細胞胚，植物體細胞胚具有和種子相同的形態(tài)發(fā)生潛力，是最有發(fā)展前景的無性繁殖方法之一。

桃兒七體細胞胚的發(fā)生技術為解決桃兒七種子、種苗匱乏和種質資源保存的問題提供了一個重要的方法和手段。目前，桃兒七組織培養(yǎng)工作已經(jīng)開展，甘肅農(nóng)業(yè)大學栗孟飛等以桃兒七成熟合子胚直接進行無菌苗繁育，獲得了桃兒七無菌苗，但是一個合子胚只能產(chǎn)生一顆苗，誘導率低，桃兒七種子資源匱乏，不能滿足桃兒七種苗的規(guī)模化生產(chǎn)。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導率高的桃兒七體細胞胚發(fā)生的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

本發(fā)明提供了一種誘導桃兒七體細胞胚發(fā)生的方法，包括以下步驟：

1)將消毒后的桃兒七種子接種于種子培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)5～7d，得到種胚，所述種子培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，pH值為5.8；

2)將步驟1)得到的種胚接種于幼苗誘導培養(yǎng)基上進行幼苗誘導培養(yǎng)32～37d，得桃兒七無菌苗，所述幼苗誘導培養(yǎng)基以MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的瓊脂，所述幼苗誘導培養(yǎng)基的pH值為5.6～5.8；

3)切取步驟2)得到的所述桃兒七無菌苗的下胚軸作為外植體，接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織培養(yǎng)，培養(yǎng)19～21d得到愈傷組織；所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，包括1.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、0.1～0.5mg/L的NAA、4.55g/L的瓊脂和30g/L的蔗糖，pH為5.6～5.8；

4)將步驟3)得到的愈傷組織接種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織胚性誘導培養(yǎng)40～50d，得到胚性愈傷組織；所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，包括1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的GA3、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的瓊脂和40g/L的蔗糖，pH值為5.6～6.2；