[發明專利]一種誘導桃兒七體細胞胚發生的方法

有效

• 申請號: 201710837774.3
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107372126B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 郭生虎;李明;陳虞超;劉華;朱永興;關雅靜;石磊;安鈺
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院農業生物技術研究中心;寧夏農林科學院荒漠化治理研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種誘導桃兒七體細胞胚發生的方法，包括以下步驟：

將消毒后的桃兒七種子接種于種子培養基上進行暗培養5~7d，得到種胚，所述種子培養基為MS固體培養基，pH值為5.8；

將步驟1）得到的種胚接種于幼苗誘導培養基上進行幼苗誘導培養32~37d，得桃兒七無菌苗，所述幼苗誘導培養基以MS固體培養基為基本培養基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的瓊脂，所述幼苗誘導培養基的pH值為5.6~5.8；所述幼苗誘導培養包括5~7天的暗培養和25~30天的光照培養；所述光照培養的光照強度為2000~3000lx，每天光照10~14h；

切取步驟2）得到的所述桃兒七無菌苗的下胚軸作為外植體，接入愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織培養，培養19~21d得到愈傷組織；所述愈傷組織誘導培養基以MS固體培養基為基本培養基，包括1.0mg/L 的2,4-D、1.0mg/L的KT、0.1~0.5mg/L 的NAA、4.55g/L的瓊脂和30g/L的蔗糖，pH為5.6~5.8；

將步驟3）得到的愈傷組織接種于胚性愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織胚性誘導培養40~50d，得到胚性愈傷組織；所述胚性愈傷組織誘導培養基以MS固體培養基為基本培養基，包括1.0mg/L 的6-BA、1.0mg/L 的GA3、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的瓊脂和40g/L的蔗糖，pH值為5.6~6.2；

將步驟4）得到的胚性愈傷組織破碎，接種于體細胞胚誘導培養基上進行體細胞誘導培養29~31d，得到體細胞胚材料；所述體細胞胚誘導培養基以MS液體培養基為基本培養基，包括0.5mg/L 的6-BA、0.1mg/L 的GA3、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值為5.8；

將步驟5）得到的體細胞胚材料接種于成熟化固體培養基上進行成熟培養12~14d，得到成熟化體細胞胚材料；所述成熟化固體培養基為以MS固體培養基為基本培養基，包括1.0mg/L 的ABA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的瓊脂和40g/L的蔗糖，pH值為5.8；

將步驟6）得到的成熟化體細胞胚材料轉入發育培養基上進行發育培養3~5d，得到發育的體細胞胚材料；所述發育培養基以MS固體培養基為基本培養基，包括20g/L的蔗糖和4.55g/L的瓊脂；

將步驟7）得到的發育的體細胞胚材料轉入萌發培養基上進行萌發培養30d，得到發育狀態相對一致的體細胞胚；所述萌發培養基以MS固體培養基為基本培養基，包括0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值為5.8。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）所述暗培養的培養溫度為22±1℃，培養濕度為40%。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3）所述愈傷組織培養的條件為光照強度為2000~3000lx，相對濕度為50~60%，培養溫度為23±1℃，每天光照12h。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4）所述愈傷組織胚性誘導培養的條件為光照強度2000~3000lx，相對濕度50~60%，溫度23±1℃，每天光照12h。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）所述體細胞誘導培養的條件為光照強度1200lx，培養溫度23±1℃。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6）所述成熟培養的條件為光照強度2000~3000lx，相對濕度50~60%，溫度23±1℃，每天光照時間12h。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟8）所述萌發培養的條件為光照強度2000~3000lx，相對濕度50~60%，溫度23±1℃，每天光照14h。

8.一種基于權利要求1~7任一項所述的方法獲得完整植株的方法，包括以下步驟：將所述體細胞胚接種于叢生芽誘導培養基上進行誘導培養4~6周，形成叢生芽并進一步發育形成完整植株；所述叢生芽誘導培養基以1/2 MS固體培養基為基本培養基，包括0.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、20g/L的蔗糖和4.6g/L的瓊脂。