[發明專利]靶向抑制沙門氏菌耐藥外排泵基因acrA的siRNA-DNA納米系統及其制備方法

有效

• 申請號: 201710835359.4
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107805643B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 王紅寧;張安云;張鵬;雷昌偉
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N1/21;C12N15/113;C12R1/42
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 楊俊華

本發明屬于微生物耐藥性研究技術領域，提供一種靶向抑制沙門氏菌耐藥外排泵基因acrA的siRNA?DNA納米系統及其制備方法。具體提供一種DNA納米載體，其為由寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈和寡核苷酸C單鏈組裝而成的類四面體結構。在此基礎上，本發明還提供DNA納米載體負載siRNA靶向外排泵基因組成的納米系統、制備方法及應用。本發明DNA納米載體具有類四面體結構，其上能夠穩定負載siRNA，并能將其安全、快速、高效地運輸到靶細胞，以抑制沙門氏菌外排泵基因表達，提高了沙門氏菌對抗生素的敏感性，進而有效抑制沙門氏菌耐藥性。

技術領域

本發明屬于微生物耐藥性研究技術領域，具體涉及一種DNA納米載體、靶向抑制沙門氏菌耐藥外排泵基因acrA的siRNA-DNA納米系統、其制備方法及應用。

背景技術

沙門氏菌是一類非常重要的革蘭氏陰性菌，能引起人畜共患疾病。革蘭氏陰性菌，尤其是沙門氏菌抗生素耐藥問題不斷加重，已成為全球關注的熱點之一。由于多重耐藥革蘭氏陰性菌的不斷蔓延，針對細菌感染的抗生素治療的失敗案例逐漸增多。世界衛生組織(WHO)宣稱，耐藥細菌已經成為威脅人類健康的主要因素之一，從而使尋找解決細菌耐藥性的方法變得更加緊迫且具有意義。研究表明，外排泵可將多種抗生素排出細菌胞外，且多重耐藥與廣泛存在于革蘭氏陰性菌中的RND外排泵過表達相關。因此，外排泵可開發為逆轉耐藥的潛在藥物作用靶標。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一個高度有效的調控過程，導致轉錄后基因的沉默。該過程是由一段長度為21-23nt的短RNA雙鏈，即小干擾RNA(siRNA)介導。目前，siRNA已經應用于多種基因的沉默，甚至疾病的治療，包括病毒感染和癌癥，但應用于細菌基因沉默的研究報道較少。由于裸露的siRNA容易降解、不穩定，有效作用時間短，為延長siRNA的作用時間，目前siRNA沉默細菌基因大都用表達載體或轉染試劑進行遞送，但該方法實驗周期長、試劑昂貴，不具有靶向性，需要高濃度過量的siRNA，且容易導致脫靶。

基于以上背景技術現狀，如何將siRNA安全、快速、高效地運輸到靶細胞是一個亟待研究的課題。

發明內容

為了解決現有技術存在的上述問題，本發明的首要目的是提供一種DNA納米載體。該DNA納米載體具有類四面體結構，其上能夠穩定負載siRNA，并能將其安全、快速、高效地運輸到靶細胞，以抑制沙門氏菌外排泵基因表達，提高了沙門氏菌對抗生素的敏感性，進而有效抑制沙門氏菌耐藥性。

根據本發明的具體實施方式，本發明的DNA納米載體，其為由寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈和寡核苷酸C單鏈組裝而成的類四面體結構，所述寡核苷酸A單鏈的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，所述寡核苷酸B單鏈的堿基序列如SEQ ID NO:2所示，所述寡核苷酸C單鏈的堿基序列如SEQ ID NO:3所示。

根據本發明的具體實施方式，本發明的另一目的是提供所述DNA納米載體的制備方法，包括以下步驟：

(1)準備原料：分別合成所述寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈和寡核苷酸C單鏈，然后分別加入一定量的ddH₂O，配制成200nM溶液作為原料備用，準備好的各原料如下表所示：