[發明專利]靶向抑制沙門氏菌耐藥外排泵基因acrA的siRNA-DNA納米系統及其制備方法

有效

• 申請號: 201710835359.4
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107805643B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 王紅寧;張安云;張鵬;雷昌偉
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N1/21;C12N15/113;C12R1/42
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 楊俊華

1.DNA納米載體，其為由寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈和寡核苷酸C單鏈組裝而成的類四面體結構，所述寡核苷酸A單鏈的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，所述寡核苷酸B單鏈的堿基序列如SEQ ID NO:2所示，所述寡核苷酸C單鏈的堿基序列如SEQ ID NO:3所示。

2.權利要求1所述的DNA納米載體的制備方法，包括以下步驟：

(1)準備原料：分別合成所述寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈和寡核苷酸C單鏈，然后取寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈以及寡核苷酸C單鏈各5μL,1×TAE/Mg²⁺15μL,分別加入一定量的ddH₂O，配制成200nM溶液作為原料備用；

(2)配置反應體系：將(1)中準備好的各原料混勻得到反應體系；

(3)反應：將(2)中反應體系依次進行95℃5min、80℃5min、70℃5min、60-30℃每10分鐘降1℃、25℃20min、20℃20min的反應，反應完畢即得所述DNA納米載體。

3.siRNA-DNA納米系統，其為由權利要求1所述的DNA納米載體與Linker-sense鏈和antisense鏈負載反應而得，所述Linker-sense鏈的堿基序列如SEQ ID NO:4所示，所述antisense鏈的堿基序列如SEQ ID NO:5所示。

4.權利要求3所述的siRNA-DNA納米系統的制備方法，包括以下步驟：

(1)準備原料：分別合成所述寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈和寡核苷酸C單鏈，然后取寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈以及寡核苷酸C單鏈各5μL,1×TAE/Mg²⁺15μL,分別加入一定量的ddH₂O，配制成200nM溶液作為原料備用；

(2)配置反應體系：將(1)中準備好的各原料混勻得到反應體系；

(3)反應：將(2)中反應體系依次進行95℃5min、80℃5min、70℃5min、60-30℃每10分鐘降1℃、25℃20min、20℃20min的反應，反應完畢即得所述DNA納米載體；

(4)負載反應：將1μL濃度為9μM的Linker-sense、antisense加入到上述DNA納米載體體系中混勻，室溫孵育30min，4℃保存即得。

5.apt-siRNA-DNA納米系統，其為由權利要求1所述的DNA納米載體與Linker-sense鏈、antisense鏈以及Aptamer-linker鏈負載反應而得，所述Linker-sense鏈的堿基序列如SEQID NO:4所示，所述antisense鏈的堿基序列如SEQ ID NO:5所示，所述Aptamer-linker鏈的堿基序列如SEQ ID NO:6所示。

6.權利要求5所述的apt-siRNA-DNA納米系統的制備方法，包括以下步驟：

(1)準備原料：分別合成所述寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈和寡核苷酸C單鏈，然后取寡核苷酸A單鏈、寡核苷酸B單鏈以及寡核苷酸C單鏈各5μL,1×TAE/Mg²⁺15μL,分別加入一定量的ddH₂O，配制成200nM溶液作為原料備用；

(2)配置反應體系：將(1)中準備好的各原料混勻得到反應體系；

(3)反應：將(2)中反應體系依次進行95℃5min、80℃5min、70℃5min、60-30℃每10分鐘降1℃、25℃20min、20℃20min的反應，反應完畢即得所述DNA納米載體；

(4)負載反應：將1μL濃度為9μM的Linker-sense、antisense和1μL濃度為3μM的Aptamer-linker加入到上述DNA納米載體體系中混勻，室溫孵育30min，4℃保存即得。