[發(fā)明專利]長效重組豬FSH融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710833452.1
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107540748B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅昊澍;師磊;韓國
• 申請（專利權(quán)）人: 北京偉杰信生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;A61K38/24;A61K47/68;A61P15/00
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發(fā)明公開了兩種長效重組豬FSH融合蛋白，包括pFSH?Fc?1和pFSH?Fc?2，其α亞基/β亞基直接或間接通過連接元件融合至Fc片段上，β亞基/α亞基通過范德華力或連接元件與α亞基/β亞基結(jié)合。所述豬FSH融合蛋白可基于基因工程技術(shù)，利用真核表達(dá)系統(tǒng)制備得到。兩種豬FSH融合蛋白藥效好，比天然豬FSH半衰期長；又不會對動物產(chǎn)生不良效應(yīng)，可替代孕馬血清促性腺激素(PMSG)在動物繁殖生產(chǎn)中的使用。本發(fā)明還涉及兩種豬FSH融合蛋白在制備動物繁殖領(lǐng)域藥物中的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種長效重組豬FSH融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬促卵泡素(Porcine Follicle-stimulating hormone，簡稱pFSH)是一種豬垂體前葉分泌的促性腺激素，由一個α亞基和一個β亞基非共價(jià)連接，其中α亞基高度保守，與豬促黃體素(Porcine Luteinizing Hormone,pLH)、豬促甲狀腺素(Porcine ThyroidStimulating Hormone,pTSH)的α亞基完全相同；β亞基存在差異，主要決定FSH的功能特異性。pFSH可以促進(jìn)母豬子宮內(nèi)膜、卵巢和卵泡的生長和成熟；促進(jìn)雌激素的合成與分泌；誘導(dǎo)公豬曲細(xì)精管的發(fā)育和維持精子生成。pFSH在動物繁殖領(lǐng)域中常用于同期發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治療。有研究表明豬FSH用于牛、羊的超排效果要好于牛羊自身的FSH，因此pFSH對畜牧生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)動物繁殖具有重要價(jià)值。

目前已有相關(guān)專利和文章報(bào)道了FSH融合蛋白的表達(dá)，但大部分是關(guān)于人FSH的重組表達(dá)與應(yīng)用，將人FSH用于動物繁殖領(lǐng)域，也獲得了一些成功。然而盡管人與家畜同屬于哺乳動物，但在蛋白序列上仍存在較大的種屬差異(人和豬FSHα亞基氨基酸序列同源性為73％，β亞基同源性為93％，F(xiàn)c片段同源性為73％)。如果長期將人重組FSH用于動物上，會被動物的免疫系統(tǒng)識別誘生抗體(包括中和抗體)，這些抗體特異性結(jié)合動物FSH的受體結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷藥物的生物學(xué)活性，導(dǎo)致人FSH在動物體內(nèi)的生物利用度越來越低，限制了人FSH在動物，尤其是需要長期使用FSH的豬、牛、羊等經(jīng)濟(jì)動物上的應(yīng)用，這也是目前市售的人重組FSH不用于動物繁殖領(lǐng)域的原因之一。

目前市面上畜用FSH產(chǎn)品主要包括豬垂體提取的FSH和孕馬血清促性腺激素(PMSG)。豬垂體FSH，如Folltropin-V(加拿大)，半衰期短(5h)，需要頻繁給藥，導(dǎo)致終端客戶給養(yǎng)和管理成本高；并且從豬垂體組織中提純時很難將豬FSH與LH分離、純化難度大、產(chǎn)能低，所以在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制。PMSG是一種馬屬動物胎盤尿囊絨毛膜細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，兼具FSH(高)和LH(低)活性，具有促進(jìn)動物卵巢和睪丸生殖機(jī)能的作用。在動物繁殖領(lǐng)域，常用于誘發(fā)雌性動物同期發(fā)情、超數(shù)排卵，治療雌性動物繁殖障礙和卵巢功能不全；促進(jìn)雄性動物曲細(xì)精管發(fā)育和精子生成。但因PMSG分子含有較高的己糖和唾液酸，在動物體內(nèi)半衰期太長(120h)，用于動物超數(shù)排卵時，容易引發(fā)母畜的多種不良效應(yīng)，如卵巢囊腫，妊娠初期胚胎的提前退化；并且商品化的PMSG從孕馬血清中提取純化，用于其它動物時會產(chǎn)生抗體，存在一定的免疫原性，不能長時間使用。此外，從懷孕母馬采集血清制備PMSG，經(jīng)常因采血過多導(dǎo)致母馬流產(chǎn)、胎馬死亡，不符合動物倫理。

因此基于人FSH不適用于動物、豬垂體FSH需要頻繁給藥、PMSG易產(chǎn)生不良效應(yīng)，動物繁殖領(lǐng)域特別是經(jīng)濟(jì)動物需要長效的動物源FSH。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型的長效重組豬FSH融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明的構(gòu)思如下：Fc融合蛋白技術(shù)是蛋白藥物長效化研發(fā)中最廣泛使用且最穩(wěn)定的技術(shù)之一，利用基因工程技術(shù)將FSH與Fc融合產(chǎn)生新型重組蛋白FSH-Fc。不僅能保留FSH的高生物活性，還可以獲得較長的半衰期；同時得到的重組蛋白純度高，質(zhì)量相對均一，不含有LH，安全系數(shù)高。使用哺乳動物表達(dá)體系，尤其是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)重組蛋白，能獲得在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然的蛋白分子。