[發明專利]長效重組豬FSH融合蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710833452.1
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107540748B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 羅昊澍;師磊;韓國
• 申請（專利權）人: 北京偉杰信生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;A61K38/24;A61K47/68;A61P15/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明公開了兩種長效重組豬FSH融合蛋白，包括pFSH?Fc?1和pFSH?Fc?2，其α亞基/β亞基直接或間接通過連接元件融合至Fc片段上，β亞基/α亞基通過范德華力或連接元件與α亞基/β亞基結合。所述豬FSH融合蛋白可基于基因工程技術，利用真核表達系統制備得到。兩種豬FSH融合蛋白藥效好，比天然豬FSH半衰期長；又不會對動物產生不良效應，可替代孕馬血清促性腺激素(PMSG)在動物繁殖生產中的使用。本發明還涉及兩種豬FSH融合蛋白在制備動物繁殖領域藥物中的用途。

技術領域

本發明涉及生物醫藥和動物繁殖技術領域，具體地說，涉及一種長效重組豬FSH融合蛋白及其制備方法與應用。

背景技術

豬促卵泡素(Porcine Follicle-stimulating hormone，簡稱pFSH)是一種豬垂體前葉分泌的促性腺激素，由一個α亞基和一個β亞基非共價連接，其中α亞基高度保守，與豬促黃體素(Porcine Luteinizing Hormone,pLH)、豬促甲狀腺素(Porcine ThyroidStimulating Hormone,pTSH)的α亞基完全相同；β亞基存在差異，主要決定FSH的功能特異性。pFSH可以促進母豬子宮內膜、卵巢和卵泡的生長和成熟；促進雌激素的合成與分泌；誘導公豬曲細精管的發育和維持精子生成。pFSH在動物繁殖領域中常用于同期發情、超數排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治療。有研究表明豬FSH用于牛、羊的超排效果要好于牛羊自身的FSH，因此pFSH對畜牧生產和經濟動物繁殖具有重要價值。

目前已有相關專利和文章報道了FSH融合蛋白的表達，但大部分是關于人FSH的重組表達與應用，將人FSH用于動物繁殖領域，也獲得了一些成功。然而盡管人與家畜同屬于哺乳動物，但在蛋白序列上仍存在較大的種屬差異(人和豬FSHα亞基氨基酸序列同源性為73％，β亞基同源性為93％，Fc片段同源性為73％)。如果長期將人重組FSH用于動物上，會被動物的免疫系統識別誘生抗體(包括中和抗體)，這些抗體特異性結合動物FSH的受體結合位點，從而阻斷藥物的生物學活性，導致人FSH在動物體內的生物利用度越來越低，限制了人FSH在動物，尤其是需要長期使用FSH的豬、牛、羊等經濟動物上的應用，這也是目前市售的人重組FSH不用于動物繁殖領域的原因之一。

目前市面上畜用FSH產品主要包括豬垂體提取的FSH和孕馬血清促性腺激素(PMSG)。豬垂體FSH，如Folltropin-V(加拿大)，半衰期短(5h)，需要頻繁給藥，導致終端客戶給養和管理成本高；并且從豬垂體組織中提純時很難將豬FSH與LH分離、純化難度大、產能低，所以在實際應用中受到很大限制。PMSG是一種馬屬動物胎盤尿囊絨毛膜細胞分泌的糖蛋白激素，兼具FSH(高)和LH(低)活性，具有促進動物卵巢和睪丸生殖機能的作用。在動物繁殖領域，常用于誘發雌性動物同期發情、超數排卵，治療雌性動物繁殖障礙和卵巢功能不全；促進雄性動物曲細精管發育和精子生成。但因PMSG分子含有較高的己糖和唾液酸，在動物體內半衰期太長(120h)，用于動物超數排卵時，容易引發母畜的多種不良效應，如卵巢囊腫，妊娠初期胚胎的提前退化；并且商品化的PMSG從孕馬血清中提取純化，用于其它動物時會產生抗體，存在一定的免疫原性，不能長時間使用。此外，從懷孕母馬采集血清制備PMSG，經常因采血過多導致母馬流產、胎馬死亡，不符合動物倫理。

因此基于人FSH不適用于動物、豬垂體FSH需要頻繁給藥、PMSG易產生不良效應，動物繁殖領域特別是經濟動物需要長效的動物源FSH。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型的長效重組豬FSH融合蛋白及其制備方法與應用。

本發明的構思如下：Fc融合蛋白技術是蛋白藥物長效化研發中最廣泛使用且最穩定的技術之一，利用基因工程技術將FSH與Fc融合產生新型重組蛋白FSH-Fc。不僅能保留FSH的高生物活性，還可以獲得較長的半衰期；同時得到的重組蛋白純度高，質量相對均一，不含有LH，安全系數高。使用哺乳動物表達體系，尤其是中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達重組蛋白，能獲得在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然的蛋白分子。