[發(fā)明專利]一種腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710830797.1
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107475250B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設計）人: 張杰豪;束文圣;周集中;葉脈;徐卓菲;劉玉蓮
• 申請（專利權）人: 廣東美格基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法。本發(fā)明前處理方法是在腸道內容物樣品中加入去腐劑清洗2遍，再加入去核酸酶溶液清洗，通過凍融法、裂解法對細胞進行裂解，充分釋放其中的DNA，最后加入蛋白酶K、SDS和RNA酶去除細胞里面的蛋白質、纖維和RNA，所得產物經常規(guī)方法即可得到腸道內容物宏基因組DNA。本發(fā)明前處理方法對于雜食性動物的腸道內容物宏基因組DNA的提取有明顯的效果，提取的純度及提取量都能滿足PCR擴增、高通量測序等下游實驗，具有很強的實用性。

技術領域

本發(fā)明屬于基因提取技術領域，更具體地說，涉及一種腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法。

背景技術

魚腸道微生物在魚類發(fā)育以及健康中起著非常重要的作用，1998年美國科學院第一次提出宏基因組學的概念，通過分析魚腸道內容物宏基因組能知道魚類平時的飲食習慣，腸道內益生菌/有害菌以及其他外來入侵菌的組成，從而更好的了解魚類腸道內環(huán)境的平衡以及菌種組成。但由于魚類在水中環(huán)境極為復雜，魚類的食物來源也多，從而導致在提取過程中出現(xiàn)降解嚴重或提取不到的情況，最主要是魚類腸道自身分泌的核酸酶對宏基因組的提取有很大的困難。

目前，對于魚腸道宏基因組提取的方法有通過糞便試劑盒，基本手提法的方法去提取。但由于存在腐蝕性魚類這一特殊的魚種，它們平時的飲食極為復雜，不僅有浮游生物，有海草，還有其他腐類物質，而往往哪些物質是非常容易使提取出來的基因組降解，所以糞便試劑盒在此種魚類的提取中基本很難提取出適合于宏基因組的研究，而基本手提法也提取不出腐蝕性魚類的宏基因組。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有方法很難在腐蝕性魚類的腸道物質中提取到宏基因組DNA等問題，提供一種腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法，該方法處理后再經常規(guī)DNA提取步驟，可高效提出完整的腸道內容物宏基因組 DNA。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其包括如下步驟：

(1)在腸道內容物樣品中加入去腐劑清洗2遍、離心去上清；

(2)加入去腐劑和1mM的EDTA溶液清洗；

(3)通過凍融法并加入10mg/ml的溶菌酶對細胞進行裂解；

(4)在65℃下加入蛋白酶K、摩爾質量為10％的SDS去除蛋白質和纖維；

(5)加入終濃度為20mg/ml的RNA酶去除RNA；

其中，所述去腐劑包括0.5M的EDTA、1M的Tris-HCl、0.1M的NaH₂PO₄、 0.1M的Na₂HPO₄和1.5M的NaCl。

作為本發(fā)明腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法的一種優(yōu)選技術方案，所述過濾除菌是使用0.22μm濾膜過濾。

作為本發(fā)明腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法的一種優(yōu)選技術方案，步驟(1)中，所述腸道內容物樣品為0.3～0.5g。可見，本發(fā)明前處理方法僅需少量樣品即可完成。

作為本發(fā)明腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法的一種優(yōu)選技術方案，步驟(1)中，所述腸道內容物樣品為魚類或人類的前腸道內容物、中腸道內容物和/或后腸道內容物；其中，腸道內容物可包括糞便、泥石、水草、魚類吞食的水體微生物等。

作為本發(fā)明腸道內容物宏基因組DNA提取的前處理方法的一種優(yōu)選技術方案，步驟(3)中，所述凍融法是-80℃冷凍15min，65℃融解5min；更進一步地，所述凍融法重復3次，使細胞更好的裂解，充分釋放其中的DNA。