[發(fā)明專利]一種腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710830797.1 | 申請日： | 2017-09-15 |
| 公開（公告）號： | CN107475250B | 公開（公告）日： | 2019-04-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張杰豪;束文圣;周集中;葉脈;徐卓菲;劉玉蓮 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣東美格基因科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 518000 廣東省深圳*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 腸道內(nèi)容物 宏基因組 前處理 清洗 高通量測序 核酸酶溶液 雜食性動物 細胞 蛋白酶K 提取量 凍融 腐劑 裂解 去除 蛋白質(zhì) 纖維 釋放 | ||
1.一種腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)在腸道內(nèi)容物樣品中加入去腐劑清洗2遍、離心去上清；
(2)加入去腐劑和1mM的EDTA溶液清洗；
(3)通過凍融法并加入10mg/ml的溶菌酶對細胞進行裂解；
(4)在65℃下加入蛋白酶K、摩爾質(zhì)量為10％的SDS去除蛋白質(zhì)和纖維；
(5)加入終濃度為20mg/ml的RNA酶去除RNA；
其中，所述去腐劑包括0.5M的EDTA、1M的Tris-HCl、0.1M的NaH2PO4、0.1M的Na2HPO4和1.5M的NaCl；
步驟(1)中，所述腸道內(nèi)容物樣品為魚類的前腸道內(nèi)容物、中腸道內(nèi)容物和/或后腸道內(nèi)容物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，步驟(1)中，所述腸道內(nèi)容物樣品為0.3～0.5g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，步驟(3)中，所述凍融法是-80℃冷凍15min，65℃融解5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，所述凍融法重復(fù)3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，步驟(3)中，所述對細胞進行裂解是在37℃下加熱25min。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，步驟(3)中，所述對細胞進行裂解后，將溫度升高到95～100℃，持續(xù)5～10min后，待溫度下降至65℃時，再進行步驟(4)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，步驟(4)中，所述加入蛋白酶K和SDS反應(yīng)的時間為1h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道內(nèi)容物宏基因組DNA提取的前處理方法，其特征在于，步驟(5)中，所述加入RNA酶反應(yīng)的時間為15min。
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