[發明專利]一種可用于牛血清白蛋白硝基化損傷檢測分析的電化學傳感器及其制備方法

在審

• 申請號: 201710826354.5
• 申請日: 2017-09-14
• 公開（公告）號: CN107655956A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 李原婷;楊小霞;常興;藺華林;韓生
• 申請（專利權）人: 上海應用技術大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 楊軍

[技術領域]

本發明屬于電分析化學和電化學傳感器技術領域，具體地說是一種可用于牛血清白蛋白硝基化損傷檢測分析的電化學傳感器及其制備方法。

[背景技術]

蛋白質硝基化(PTN)損傷是指蛋白質分子中的酪氨酸殘基硝基化為3-硝基酪氨酸(3-NT)。作為一種重要的蛋白質翻譯后的修飾，3-NT的生成使蛋白質的結構與功能發生改變，最終誘導細胞損傷、細胞凋亡和疾病的發生。近年來，在多種心血管疾病、炎癥、神經退行性疾病等病變的相應組織蛋白中都可以檢測到3-NT的存在。因此，開發蛋白質硝基化損傷的分析檢測方法，對于研究與人類死亡率較高的疾病如心腦血管疾病的發病機制以及疾病的早期診斷具有重要的應用價值。大量研究表明，PTN是體內一系列氧化應激的結果。其中，NO與O2·-反應生成的過氧亞硝酸根離子(ONOO-)是引起蛋白質酪氨酸硝基化損傷的主要因素。

目前，蛋白質硝基化損傷的主要研究方法需要的儀器設備昂貴，前樣本處理過程復雜且樣品損失嚴重，還面臨如何將修飾后蛋白樣品從復雜體系中純化出來等問題。電化學傳感器已廣泛應用于基礎研究、生物組分檢測、臨床疾病診斷、過程控制與檢測、環境監控與保護等領域，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復雜的體系中直接原位檢測等特點，是解決上述問題的有利方法。

因此，有必要研究利用電化學傳感器進行蛋白質硝基化的檢測分析。

[發明內容]

本發明的目的就是要解決上述的不足而提供一種可用于牛血清白蛋白硝基化損傷檢測分析的電化學傳感器，不僅能夠有效檢測牛血清白蛋白的硝基化，且傳感器制備過程簡單，無須樣品預處理，檢測速度快，有較強的應用價值，解決了現有蛋白質硝基化分析檢測技術中儀器設備昂貴、前處理復雜、樣品損失嚴重等不足。

為實現上述目的設計一種可用于牛血清白蛋白硝基化損傷檢測分析的電化學傳感器，包括工作電極、參比電極和輔助電極構成的三電極體系，所述工作電極為玻碳基底表面電沉積有納米金/石墨烯/氯化高鐵血紅素復合材料修飾的玻碳電極。

本發明還提供了一種可用于牛血清白蛋白硝基化損傷檢測分析的電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟：

1)納米金/氧化石墨烯/氯化高鐵血紅素復合電沉積液的制備：首先配制HAuCl₄儲備液：將HAuCl₄溶解于去離子水中，震蕩搖勻，并于2-8℃保存，使用前稀釋；再配制氧化石墨烯GO溶液：取Hummer法制備的氧化石墨烯GO與去離子水混合，超聲30min；配制氯化高鐵血紅素hemin溶液：稱取氯化高鐵血紅素hemin與無水乙醇混合，加入氨水超聲30min溶解，并于2-8℃保存；將上述配制的HAuCl₄溶液、GO溶液和hemin溶液按5:1-2:5的比例混合，得到電沉積液；

2)納米金/石墨烯/氯化高鐵血紅素復合材料修飾電極的制備：首先，玻碳電極的預處理：先用Al₂O₃拋光粉對電極進行打磨，經水沖洗后，再用電流-時間曲線技術對玻碳電極在0.1M pH7.0的磷酸鹽緩沖液PBS進行活化，活化電位2.0V，活化時間200s；然后，納米金/石墨烯/氯化高鐵血紅素復合材料的一步電沉積：利用循環伏安技術，將玻碳電極在步驟1)所得的電沉積液中進行原位沉積，掃描電位范圍為-1.5-0.6V，掃速為0.025V/s，掃描圈數為20圈，即制備得到納米金/石墨烯/氯化高鐵血紅素復合材料修飾的玻碳電極；再進一步對上述修飾電極進行常規的電化學性能測試，結果良好。

所述電化學傳感器應用于牛血清白蛋白的硝基化損傷檢測分析，靈敏度、準確度均良好。其具體檢測條件為，測定介質：0.1M pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液；測定溫度：37℃；測定方法：差分脈沖伏安法；掃描電位范圍：0.1-0.6V。

所述電化學傳感器對牛血清白蛋白硝基化損傷檢測的方法，包括如下步驟：

1)首先配制牛血清白蛋白溶液：稱取牛血清白蛋白與pH7.4的PBS混合均勻作為儲備液，并于4℃保存，使用前稀釋到10^-3μg/mL，然后在4℃條件下，將納米金/石墨烯/氯化高鐵血紅素復合材料修飾電極浸泡在10^-3μg/mL的BSA溶液中6小時，用去離子水沖洗備用，得到電化學生物傳感器；

2)在37℃恒溫條件下，將步驟1)所得的電化學生物傳感器置于pH7.4的PBS中，孵化5分鐘，在hemin作用下催化BSA的硝基化，采集差分脈沖伏安曲線，掃描電位范圍為0.1-0.6V；