[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的上轉(zhuǎn)換?免疫層析試紙條及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710825336.5
• 申請日: 2017-09-14
• 公開（公告）號: CN107632161A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣健暉;唐麗娟
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 天津合志慧知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)12219
• 代理人: 陳松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的上轉(zhuǎn)換-免疫層析試紙條及檢測方法。

背景技術(shù)

隨著科技的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在我們身邊并不少見，尤其是轉(zhuǎn)基因糧食及其衍生產(chǎn)品，CP4EPSPS被應(yīng)用于多種作物的轉(zhuǎn)基因研究中，包括玉米、大都、棉花、油菜、甜菜和苜蓿。隨著各種各樣的轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)入市場，轉(zhuǎn)基因食品的安全性受到人們的日益關(guān)注，世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在著較大的正義，日本、歐盟等地區(qū)制定了相關(guān)法規(guī)對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行了嚴(yán)格的管理。因此，轉(zhuǎn)基因蛋白的檢測逐漸成為研究熱點之一。由于轉(zhuǎn)基因檢測的特殊性，要求檢測方法必須簡單、快速，而且成本要低。目前轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的檢測方法主要實用實時定量PCR手段，由于PCR方法學(xué)的可靠性取決于DNA的完整性，但是在實驗處理的過程中DNA容易發(fā)生降解，因此，該方法存在一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的上轉(zhuǎn)換-免疫層析試紙條及檢測方法，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的簡單、快速、低成本的試紙條檢測方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

一種檢測轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的上轉(zhuǎn)換-免疫層析試紙條，所述試紙條包括樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊，所述樣品墊與結(jié)合墊為玻璃纖維素膜，所述分析膜為硝酸纖維素膜，所述吸水墊為纖維素膜，所述分析膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊依次粘貼在PVC板上；

所述結(jié)合墊上固定有上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子-轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS單抗1結(jié)合物，所述分析膜上的檢測線固定有轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS單克隆抗體2，所述質(zhì)控線固定有二抗。

進(jìn)一步的，所述樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊依次以重疊1～2mm的間距交互層疊黏貼到PVC板上，所述試紙條的寬度為4mm。

檢測轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的上轉(zhuǎn)換-免疫層析試紙條的制備方法包括以下步驟：

(1)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄上轉(zhuǎn)換納米粒子的制備；

(2)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄的高分子的包覆；

(3)上轉(zhuǎn)換納米粒子標(biāo)記抗體；

(4)上轉(zhuǎn)換免疫層析法的試紙條的制作；

(5)結(jié)合物溶液的配置和包被；

(6)質(zhì)控溶液和檢測溶液的配置和包被；

(7)雙抗體夾心模式UCPs-ICA定量檢測轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS；

進(jìn)一步的，所述步驟(1)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄上轉(zhuǎn)換納米粒子的制備方法如下：

S1：NaYF₄:Yb,Tm的制備

往三口燒瓶中加入2～5mL油酸，再加入1.2～3mmol稀土離子氯化物晶體粉末，控制各種稀土元素的摩爾比例為Y:Yb:Tm＝60％:25％:4％。在稀有氣體氬氣流的保護(hù)下，隔絕空氣加熱到110～130℃，保溫20min。迅速加入5～14mL 1-十八烯，然后慢慢加熱到150℃，慢慢滴加10mL溶解NH₄F和NaOH的甲醇溶液到上述體系中，其中NH₄F為6mmol,NaOH為3mmol，滴加完畢50℃繼續(xù)攪拌40min，慢慢升溫至100℃，抽真空，在Ar氣保護(hù)下迅速升溫至300℃，反應(yīng)60～80min。反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫，反應(yīng)產(chǎn)物在5000rpm下離心6min，沉淀用乙醇反復(fù)洗滌2-3次，最后將所得產(chǎn)品溶于5mL環(huán)己烷中保存待用；

S2：NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄的制備