[發明專利]轉基因蛋白CP4EPSPS的上轉換?免疫層析試紙條及檢測方法

在審

• 申請號: 201710825336.5
• 申請日: 2017-09-14
• 公開（公告）號: CN107632161A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發明（設計）人: 蔣健暉;唐麗娟
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙)12219
• 代理人: 陳松

1.檢測轉基因蛋白CP4EPSPS的上轉換-免疫層析試紙條，其特征在于：所述試紙條包括樣品墊、結合墊、分析膜、吸水墊，所述樣品墊與結合墊為玻璃纖維素膜，所述分析膜為硝酸纖維素膜，所述吸水墊為纖維素膜，所述分析膜上設有檢測線和質控線，所述樣品墊、結合墊、吸水墊依次粘貼在PVC板上；

所述結合墊上固定有上轉換發光納米粒子-轉基因蛋白CP4EPSPS單抗1結合物；

所述分析膜上的檢測線固定有轉基因蛋白CP4EPSPS單克隆抗體2，所述質控線固定有二抗。

2.根據權利要求1所述的檢測轉基因蛋白CP4EPSPS的上轉換-免疫層析試紙條，其特征在于：所述樣品墊、結合墊、分析膜、吸水墊依次以重疊1～2mm的間距交互層疊黏貼到PVC板上，所述試紙條的寬度為4mm。

3.權利要求1～2任一項所述的檢測轉基因蛋白CP4EPSPS的上轉換-免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于：該制備方法包括以下步驟：

(1)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄上轉換納米粒子的制備；

(2)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄的高分子的包覆；

(3)上轉換納米粒子標記抗體；

(4)上轉換免疫層析法的試紙條的制作；

(5)結合物溶液的配置和包被；

(6)質控溶液和檢測溶液的配置和包被；

(7)雙抗體夾心模式UCPs-ICA定量檢測轉基因蛋白CP4EPSPS。

4.根據權利要求3所述的檢測轉基因蛋白CP4EPSPS的上轉換-免疫層 析試紙條的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄上轉換納米粒子的制備方法如下：

S1：NaYF₄:Yb,Tm的制備

往三口燒瓶中加入2～5mL油酸，再加入1.2～3mmol稀土離子氯化物晶體粉末，控制各種稀土元素的摩爾比例為Y:Yb:Tm＝60％:25％:4％。在稀有氣體氬氣流的保護下，隔絕空氣加熱到110～130℃，保溫20min。迅速加入5～14mL 1-十八烯，然后慢慢加熱到150℃，慢慢滴加10mL溶解NH₄F和NaOH的甲醇溶液到上述體系中，其中NH₄F為6mmol,NaOH為3mmol，滴加完畢50℃繼續攪拌40min，慢慢升溫至100℃，抽真空，在Ar氣保護下迅速升溫至300℃，反應60～80min。反應完畢后，冷卻至室溫，反應產物在5000rpm下離心6min，沉淀用乙醇反復洗滌2-3次，最后將所得產品溶于5mL環己烷中保存待用；

S2：NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄的制備

將2～5mL油酸加入圓底燒瓶中，再加入0.5mmol YCl₃·6H₂O晶體粉末，加熱到140℃使晶體粉末溶解完全，并除去結晶水，升溫到150℃，保溫20min，迅速加入5～13mL1-十八烯，并加熱到120℃，保溫30min，反應完畢并冷卻到50℃，此時交替滴加5mL上述NaYF₄核的環己烷溶液和4～8mL含有4mmol NH₄F、2.5mmol NaOH的甲醇溶液，滴加完畢，恒溫攪拌40min,慢慢升溫到100℃除盡環己烷和甲醇，迅速升溫到300℃反應90min，反應完畢后冷卻到室溫，燒瓶內的反應產物5000rpm離心5min,沉淀用乙醇反復洗滌2-3次。將所得淡黃色上轉換納米顆粒溶解于10mL氯仿中保存待用。

5.根據權利要求3所述的檢測轉基因蛋白CP4EPSPS的上轉換-免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)的制備方法如下：

準確稱取1～5mg兩親性嵌段共聚物于圓底燒瓶中，加入體積比為1：3的氯仿和乙醇的混合溶液，然后加入200uL步驟(1)制備好的上轉換納米粒子，混合均勻，將混合物置于旋轉蒸發儀上，保持35℃水浴恒溫，減壓使其緩慢蒸干，再加入5mL弱堿性的磷酸鹽緩沖溶液，懸濁液呈白色，離心洗滌5～10次，離心管底部的粒子用10mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液溶解，得到pH中性的Poly-NaYF₄:Yb,Er/NaYF₄的懸濁液，4℃避光保存備用。