[發明專利]牛A型產氣莢膜梭菌的亞單位疫苗及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710819084.5
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN107596361B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;張強;王娟;白志軍;查銀河
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/08
• 分類號: A61K39/08;A61P31/04;C07K14/33;C12N15/70
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發明提供了一種牛A型產氣莢膜梭菌的亞單位疫苗以及制備方法和應用，所述亞單位疫苗包括牛A型產氣莢膜梭菌α?毒素蛋白截短體以及藥學上可以接受的佐劑，所述α?毒素蛋白截短體為α?毒素蛋白的從氨基酸255位到氨基酸372位的抗原決定簇氨基酸序列。所述亞單位疫苗具有以下優勢：1)不存在滅活不徹底導致的安全性問題；2)質量可控，不存在批次間差異；3)生產設備和空間要求較低，表達量高，成本低；4)不存在散毒的風險，生產操作人員的安全有保障。

技術領域

本發明涉及牛A型產氣莢膜梭菌亞單位疫苗的制備和應用，屬于獸用生物制品技術領域。

背景技術

A型產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是自然界和動物腸道中的厭氧的能產芽孢并且耐熱的條件致病菌。該病導致的牛腸毒血癥和牛猝死癥等均具有發病急、病程短、死亡率高等特點。所以藥物往往起不到好的治療效果。

A型產氣莢膜梭菌主要產生α-毒素，該毒素是主要的免疫原，能夠刺激機體產生中和性抗體。因此，α-毒素是亞單位疫苗設計的主要靶抗原。但α-毒素具有磷脂酶C活性，能將細胞膜的磷脂酰膽堿水解，細胞膜完整性受到破壞，最終導致細胞破裂死亡，因此其具有細胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性。因此，設計表達α-毒素時須考慮將磷脂酶C活性失活。

目前，有將α-毒素進行截短表達，以獲得不含毒性但保留免疫原性的α-毒素截短體(具體參見公開號為CN93107585的發明專利)；有將表達出來的α-毒素進行滅活處理，以獲得喪失毒性的α-毒素(具體參見公開號為CN200680021810的發明專利)。但是，由于當時技術條件的限制，截短表達時截短位置或長或短，這不僅可能會影響目的蛋白的免疫原性，也可能會降低目的蛋白的產量，導致生產成本較高；另外將野生型的α-毒素進行滅活可能存在滅活不徹底而帶來的毒性，也增加了生產工藝的步驟和時間，會導致生產成本的升高，影響疫苗的生產銷售。

發明內容

本發明要解決的技術問題一是提供一種可大規模工業化生產的牛A型產氣莢膜梭菌亞單位疫苗及其制備方法；二是克服現有技術中截短位置或長或短可能帶來的缺陷；三是克服現有技術中對α-毒素進行滅活時可能存在的缺陷。

根據本發明的一個方面，本發明提供了一種牛A型產氣莢膜梭菌亞單位疫苗，所述亞單位疫苗包括牛A型產氣莢膜梭菌的α-毒素蛋白截短體以及藥學上可以接受的佐劑，所述α-毒素蛋白截短體為α-毒素蛋白的從氨基酸255位到氨基酸372位的抗原決定簇氨基酸序列

本發明的技術方案中，優選地，所述α-毒素蛋白截短體的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本發明的技術方案中，優選地，所述藥學上可以接受的佐劑為ISA 201VG佐劑，所述α-毒素蛋白截短體與佐劑的重量比為1:1。

本發明的技術方案中，優選地，所述亞單位疫苗中每頭份含有30～200μgα-毒素蛋白截短體。

本發明的技術方案中，優選地，所述亞單位疫苗中每頭份含有100μgα-毒素蛋白截短體。

根據本發明另一個方面，本發明還提供了一種制備α-毒素蛋白截短體的方法，所述方法包括以下步驟：1)將α-毒素蛋白的核苷酸序列進行密碼子優化，得到密碼子優化后的α毒素蛋白核苷酸序列，將密碼子優化后的α毒素蛋白核苷酸序列通過PCR擴增出α-毒素蛋白截短體的核苷酸序列；2)將α-毒素蛋白截短體的核苷酸序列插入到pET28a載體中，得到重組載體；3)將重組載體轉入轉化E.coli BL21(DE3)，誘導表達、純化后獲得α-毒素蛋白截短體。

本發明的技術方案中，優選地，所述密碼子優化后PCR擴增出的α-毒素蛋白截短體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根據本發明另一個方面，本發明還提供了一種亞單位疫苗在牛A型產氣莢膜梭菌治療和預防中的應用。