[發明專利]一種草魚腸巨噬細胞的分離、純化與原代培養方法

有效

• 申請號: 201710816631.4
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN107523542B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 李槿年;肖寧;陶會竹;趙雨婷;李琳;劉雪蘭
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 合肥和瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 34118
• 代理人: 王挺;鄭琍玉

1.一種草魚腸巨噬細胞的分離方法，其特征在于包括以下步驟：

S1、在無菌環境下，獲得健康草魚中后段腸道之后對所述腸道做預處理，所述預處理的操作為：將所述腸道外脂肪與腸系膜除去，縱向剖開腸管并清除糞便，之后刮除腸道黏液以及上皮細胞層，最后用PBS緩沖液振蕩清洗，得到腸壁明顯變薄且腸壁顏色變為淡黃色至白色的腸段；

S2、將所述腸段充分處理成碎塊，并加入到膠原酶IV消化液中進行振蕩消化，消化結束后過濾得到濾液，將所述濾液進行離心處理獲得細胞沉淀物，將所述細胞沉淀物配制成腸黏膜固有層單細胞懸液；

S3、從所述腸黏膜固有層單細胞懸液中分離得到腸巨噬細胞；

所述步驟S1中健康草魚中后段腸道的獲取操作為：用自來水沖洗健康草魚的體表后敲打草魚頭部致死，立即放入75％乙醇中浸泡20s，取出腸道中后段；所述預處理在含有預冷的PBS緩沖液的培養皿中進行，腸段用PBS緩沖液振蕩清洗3次，所述PBS緩沖液的濃度0.01mol/L，pH7.4；

所述步驟S1中，采用無菌彎頭鑷子刮除腸黏液與上皮細胞層；

所述步驟S2中碎塊的體積＜1mm³，所述碎塊置于膠原酶IV消化液中放入28℃振蕩培養箱振蕩消化2h，所述振蕩培養箱的轉速為250轉/分鐘；消化結束將所述膠原酶IV消化液過400目篩網獲得濾液，之后將所述濾液以1800rpm離心8min并收集細胞沉淀物，使用Hank's平衡液洗滌所述細胞沉淀物，并使用所述Hank's平衡液將所述細胞沉淀物配成濃度為1×10⁸個/mL的腸黏膜固有層單細胞懸液；

所述的膠原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及膠原酶IV組成，所述胎牛血清在膠原酶IV消化液中的質量濃度為1.7mg/mL，所述Hank’s平衡液在膠原酶IV消化液中的體積百分數為95％，所述胎牛血清在膠原酶IV消化液中的體積百分數為5％；

步驟S3具體為：

在15mL離心管中依次緩慢加入3mL分離液1，2mL分離液2，制成梯度界面；吸取5mL上述制好的單細胞懸液加在分離液液面上，1800rpm/min離心30min，此時離心管內容物被分為五層，由上而下依次是稀釋液層、環狀乳白色上層、環狀乳白色下層、分離液層和紅細胞層；用巴氏吸管小心吸取環狀乳白色上層至另一15mL離心管中，用Hank's平衡液洗3次，1800rpm/min離心8min，棄上清，用1mL RPMI 1640基礎培養液培養液重懸細胞沉淀；

所述RPMI 1640基礎培養液由RPMI 1640培養液、胎牛血清以及抗微生物液組成，所述RPMI 1640培養液、胎牛血清以及抗微生物液在RPMI 1640基礎培養液中的體積百分數分別為94％、5％、1％。

2.一種如權利要求1所述草魚腸巨噬細胞的純化方法，其特征在于：用RPMI 1640基礎培養液將所述腸巨噬細胞稀釋后接種于細胞培養板并在培養箱中培養，培養4h后進行第一次換液，繼續培養至12h后進行第二次換液，最終獲得純化后的草魚腸巨噬細胞；換液時棄去全部陳舊培養液并加入新鮮的含草魚自體血清的RPMI 1640完全培養液。

3.如權利要求2所述草魚腸巨噬細胞的純化方法，其特征在于：所述腸巨噬細胞稀釋后濃度為3×10⁶個/mL；所述細胞培養板為96孔細胞培養板，所述細胞培養板接種量為100μL/孔；所述培養箱內溫度28℃、CO₂體積含量5％。

4.如權利要求1所述草魚腸巨噬細胞的純化方法，其特征在于：所述的含草魚自體血清的RPMI 1640完全培養液由RPMI 1640培養液、胎牛血清、草魚自體血清以及抗微生物液構成，所述RPMI 1640培養液、胎牛血清、草魚自體血清以及抗微生物液在RPMI 1640完全培養液中的體積百分數分別為84％、10％、5％、1％。