[發明專利]一種草魚腸巨噬細胞的分離、純化與原代培養方法

有效

• 申請號: 201710816631.4
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN107523542B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 李槿年;肖寧;陶會竹;趙雨婷;李琳;劉雪蘭
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 合肥和瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 34118
• 代理人: 王挺;鄭琍玉

本發明涉及一種草魚腸巨噬細胞的分離、純化與原代培養方法。分離方法為：無菌操作取出腸道中后段，除去腸道外脂肪與腸系膜，縱向剖開腸管清除糞便，使用無菌彎頭鑷子刮除草魚腸黏液與上皮細胞層，刮除時間15min；將除去黏液和上皮細胞層的腸段處理成碎塊置于膠原酶IV消化液中消化，獲得固有層單細胞懸液；再用魚類臟器單核細胞分離試劑盒分離腸巨噬細胞。純化方法為：采用差異貼壁法純化腸巨噬細胞。原代培養方法為：用含草魚自體血清的RPMI 1640完全培養液培養腸巨噬細胞，待細胞貼壁后用含脂多糖的RPMI 1640完全培養液換液一次，以后每隔2天換液一次，細胞至少可存活20天。本發明建立了一種可操作性強、重復性好的草魚腸巨噬細胞分離、純化和原代培養方法。

技術領域

本發明屬于魚類細胞培養技術領域，具體涉及一種草魚腸巨噬細胞的分離、純化與原代培養方法。

背景技術

腸道既是硬骨魚類的消化吸收器官，也是其黏膜免疫器官。研究表明魚類腸道不具有哺乳動物的組織化淋巴器官(如，Peyer氏淋巴集結及濾泡淋巴結),但在腸道中后段黏膜層分布著大量巨噬細胞(Macrophages)、淋巴細胞和粒細胞等免疫細胞，其中黏膜固有層富含的腸巨噬細胞除具有吞噬、殺傷和清除腸道病原微生物的功能外，還扮演著抗原遞呈細胞的角色，發揮啟動和調節腸黏膜免疫應答的作用。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是中國四大家魚之一，年產量超過400萬噸，在所有淡水養殖魚類中居首位。但隨著草魚養殖業的快速發展，疾病已成為制約其健康可持續發展的重要因素。疫苗接種是控制草魚疫病的有效手段，而口服疫苗是水產養殖生產中最適用的疫苗類型。草魚腸巨噬細胞的活性與功能是評價口服疫苗誘導的免疫應答水平，尤其是腸黏膜免疫水平的重要指標。由于巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2-3周，多用做原代培養，并且原代培養細胞與體內細胞的特性接近，能較真實地反映體內細胞的活性與功能。因此，很有必要建立規范的、可復制的草魚腸巨噬細胞分離、純化和原代培養方法，為檢測草魚腸道黏膜免疫水平，評價口服疫苗的免疫效果提供試驗平臺。

現有的魚類巨噬細胞分離培養技術中，從外周血、腹腔和頭腎中分離巨噬細胞的方法已經比較成熟，且文獻報道較多。然而，有關魚類腸巨噬細胞的分離、純化和原代培養方法尚未見有報道。首先，草魚腸道細長彎曲、腸壁構成復雜，腸黏膜表面覆蓋著大量黏液，巨噬細胞所在的固有層又含有致密的結締組織，導致了草魚腸巨噬細胞的分離存在困難。陸生恒溫動物(小鼠、大鼠等)腸巨噬細胞的分離多采用DTT(硫蘇糖醇)-EDTA(乙二胺四乙酸)分離法，并取得很好的分離效果。但我們的前期研究發現這種方法不適合生活在水環境中的變溫動物草魚，DTT-EDTA對草魚巨噬細胞有損傷，細胞活力大大下降，培養12h后細胞就發生死亡。其次，草魚腸巨噬細胞表面標記分子還知之甚少，也無標記分子特異性單克隆抗體，這給草魚腸巨噬細胞的純化帶來難度。最后，適合于草魚腸巨噬細胞原代培養的條件也不清楚。因此，如何有效分離、純化和原代培養草魚腸巨噬細胞成為亟待解決的技術問題。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種草魚腸巨噬細胞的分離、純化與原代培養方法。

為了實現本發明的第一個目的，本發明采用了以下技術方案：

一種草魚腸巨噬細胞的分離方法，包括以下步驟：

S1、在無菌環境下，獲得健康草魚中后段腸道之后對所述腸道做預處理，所述預處理的操作為：將所述腸道外脂肪與腸系膜除去，縱向剖開腸管并清除糞便，之后刮除腸道黏液以及上皮細胞層，最后用PBS緩沖液振蕩清洗，得到腸壁明顯變薄且顏色變為淡黃色至白色的腸段；

S2、將所述腸段充分處理成碎塊，并加入到膠原酶IV消化液中進行振蕩消化，消化結束后過濾得到濾液，將所述濾液進行離心處理獲得細胞沉淀物，將所述細胞沉淀物配制成腸黏膜固有層單細胞懸液；

S3、按照魚類臟器單核細胞分離試劑盒的說明從所述腸黏膜固有層單細胞懸液中分離得到腸巨噬細胞。