[發明專利]一種阿侖膦酸鈉的高靈敏寬檢測范圍熒光檢測新方法

在審

• 申請號: 201710816613.6
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN107655871A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 張普;賈春燕;尚京川
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司50209
• 代理人: 高彬

技術領域

本發明涉及阿侖膦酸鈉熒光檢測，具體涉及一種阿侖膦酸鈉的高靈敏寬檢測范圍熒光檢測新方法。

背景技術

阿侖膦酸鈉(Alendronate sodium，ALDS)，化學名為(4-氨基-1-羥基亞丁基)二膦酸單鈉鹽三水合物，是第三代氨基二膦酸鹽類骨吸收抑制劑。阿侖膦酸鈉與骨內羥基磷灰石有很強親和力，能進入骨基質羥基磷灰石晶體中抑制破骨細胞活性，并通過成骨細胞間接抑制骨吸收，臨床上主要用于治療骨質疏松癥和變形性骨炎。由于阿侖膦酸鈉的分子結構中含有兩個膦酸基團，極性強，易電離，無發色基團，因而不能直接用常規的紫外檢測器或熒光檢測器測定該藥物含量。現行的國家標準(WS1-(X-312)-2004Z[18])中阿侖膦酸鈉片含量采用測量誤差較大的鉬藍比色法，不利于控制藥品的質量。李赟等人在《藥學與臨床研究》雜志報道了Cu²⁺絡合反相離子對色譜-紫外檢測法測定阿侖膦酸鈉片的含量，但該方法需要將阿侖膦酸鈉與Cu²⁺劇烈振搖40min后形成較好的復合物，而且靈敏度差，檢測線性范圍較窄，不適用于生物樣品的檢測。另有文獻報道采用高效液相色譜法來檢測藥物制劑或生物樣品中阿侖膦酸鈉的含量，由于阿侖膦酸鈉不具有生色基團，需要先用鄰苯二甲醛、重氮甲烷、氯甲酸芴等衍生劑經過衍生化生成紫外吸收基團，該方法需要經過繁瑣的固相萃取過程，操作復雜，同時重氮甲烷具有爆炸性和毒性，存在安全隱患。因此，開發操作簡便、快速、靈敏度高、檢測線性范圍更廣的阿侖膦酸鈉檢測新方法具有十分重要的意義。

發明內容

為了解決現有技術中的問題，本發明的目的在于提供一種阿侖膦酸鈉的熒光檢測新方法，該方法操作簡單，且靈敏度高、檢測范圍寬。

本發明的目的是這樣實現的：

一種阿侖膦酸鈉的熒光檢測方法，其特征在于：先利用銅離子(Cu²⁺)猝滅寡聚核苷酸穩定的銀納米簇(以下簡稱DNA-AgNCs)的熒光，降低背景信號，然后樣品中阿侖膦酸鈉與銅離子通過配位結合形成復合物使得銅離子遠離DNA-AgNCs探針，從而使DNA-AgNCs的熒光恢復，其熒光恢復程度與阿侖膦酸鈉濃度呈線性關系，做標準曲線計算樣品中阿侖膦酸鈉的含量。

本發明阿侖膦酸鈉的檢測方法，其特征在于：將Cu²⁺、DNA-AgNCs、含阿侖膦酸鈉的樣品在PB緩沖液中反應，反應結束后在熒光分光光度計上掃描200-800nm的最大激發波長與最大發射波長，同時做空白試驗；根據最大激發波長下，最大發射波長處的熒光強度變化與阿侖膦酸鈉標準品濃度所做的標準曲線，即可算出樣品中阿侖膦酸鈉的含量。

作為優化，上述阿侖膦酸鈉的檢測方法，其特征在于：將DNA-AgNCs、Cu²⁺、阿侖膦酸鈉標準品在PB緩沖液中反應；所述Cu²⁺的濃度為25-1200nmol/L；所述PB緩沖液的pH為5.8-8.0。

作為進一步優化，上述阿侖膦酸鈉的熒光檢測方法，其特征在于：將DNA-AgNCs、Cu²⁺、阿侖膦酸鈉標準品在PB緩沖液中反應；所述Cu²⁺的濃度為500-1200nmol/L；所述PB緩沖液的pH為7.0-8.0。

作為更進一步優化，上述阿侖膦酸鈉的熒光檢測方法，其特征在于，采用如下步驟：先將阿侖膦酸鈉標準品加入到Cu²⁺(800nmol/L)和PB緩沖液(pH 7.4)混合溶液中混勻，室溫下靜置15min；然后再加入DNA-AgNCs混勻，室溫下靜置20min；之后在熒光分光光度計上設置最大激發波長為590nm，掃描605-750nm的熒光發射光譜，以最大發射波長640nm處的熒光強度進行定量，同時做空白試驗；所述樣品中阿侖膦酸鈉的含量按下式計算：

Y＝0.02382X+1.086(標準曲線方程)

式中：

Y為相對熒光強度(F/F₀，其中F表示有阿侖膦酸鈉時的熒光強度，F₀表示沒有阿侖膦酸鈉時的熒光強度)；X為阿侖膦酸鈉標準品的濃度(單位：μmol/L)。

一種阿侖膦酸鈉的熒光檢測方法，包括空白試驗、樣品檢測及計算結果步驟，其特征在于：

(1)空白試驗：