[發明專利]一種吸收率達到96%的納米級膠原蛋白提純方法

在審

• 申請號: 201710814113.9
• 申請日: 2017-09-09
• 公開（公告）號: CN109486885A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 田娟
• 申請（專利權）人: 上海新肌生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/18;C07K1/34
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1.一種吸收率達到96%的納米級膠原蛋白提純方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）粉碎：先對魚皮進行精華檢測，即分為抗生素檢測、重金屬殘留檢測、雌性激素檢測和動物源毒素殘留檢測，然后將魚皮加入超純水浸泡，直到含有膠原蛋白的原料凍成松散的組織顆粒，用玻璃棒攪拌均勻，成糊狀；將糊狀的組織顆粒再加入10倍體積的超純水，按組織搗碎機的操作規程勻漿3次，至完全懸浮；將組織顆粒絞碎均勻后加入超純水至組織的含量為25克／升，混勻；加冰醋酸至組織懸浮液，調制溶液濃度0.5毫克/毫升；消化：稱取胃蛋白酶，將胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后轉入到組織懸浮液至0.1mg/ml，即每100ml勻漿中加入1ml的胃蛋白酶溶液，混勻，室溫消化7-10天；

2）去除雜質：將粉碎物置于低溫攪拌機中，按照粉碎物與無離子水體積比為1:3的比例進行攪拌混合30分鐘；靜止10分鐘后除去上層浮物，然后置于過濾裝置中，進行吸附過濾，收集過濾后的粉碎物；

3）第一次分解：中第一次分解包括以下步驟：將步驟2)中的粉碎物與水以體積比為1:3的比例混合得混合物，并將溫度調節至30℃，溫度pH為7；將含有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的培養液以體積比2:1的比例攪拌混合5分鐘，加入到混合物中；勻速攪拌，在溫度30℃，pH為7下保持24小時；混合液置入高速離心機中的離心罐中，離心15分鐘，靜止沉淀10分鐘；將上述混合物進行提純，提取純方法采用膜分離法，采用3000Da和1000Da的超濾膜截留離心后的上清液，分離得到3000Da-1000Da的膠原蛋白肽組分；置于真空過濾裝置中，抽濾，干燥，滅菌；

4）第二次分解：將第一次分解獲得的產物與水以體積比為60：40的比例混合，在35℃溫度下恒溫攪拌30分鐘；按膠原蛋白原料重量的0.5％向混合液中加入胰蛋白酶，按膠原蛋白原料重量的5％加入聚二乙醇，繼續攪拌10分鐘；調節pH值為7-8，37℃，反應8小時；迅速加熱至45℃，終結酶活；混合液放入高速離心機中的離心罐中，離心15分鐘；將上述混合物進行提純，提取純方法采用膜分離法，采用1000Da的超濾膜截留離心后的上清液，分離得到1000Da以下的膠原蛋白肽組分；

5）第一次提純：在上述步驟中得到的1000Da以下的膠原蛋白肽組分加入陰離子交換樹脂，攪拌浸泡3-3.5h,讓樹脂完全吸附料液的色素和腥味；用層析柱將料液和樹脂分離；殺菌，殺菌后過濾，將料液通過超濾膜分離裝置過濾，得超濾透析液；離心提純：將透析后的溶液高速冷凍離心，最后通過微分子對撞工藝進行最后的提純，所得沉淀為最后純化的膠原蛋白；

6）第二次提純：再將最后純化后的膠原蛋白，經過一種納米級膠原蛋白提純設備（我公司專利設備）提純之后得到納米級混合粉；

7）納米級混料進行對撞：將混合的納米級膠原蛋白粉，置于粒子對撞儀中，進行對撞，最終得到分子量比較品均的納米級膠原蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種吸收率達到96%的納米級膠原蛋白提純方法，其特征在于：所述的吸附過濾具體為用配置好的10MNaOH標準溶液調節消化液pH至9-9.5，靜置過夜，滅活胃蛋白酶；調節pH值：消化液中加入等體積的超純水,并用濃鹽酸調節pH到4.0，攪拌2小時；清洗硅藻土：根據調節pH值后的消化液體積，按濃度為15g/L稱取硅藻土，將硅藻土用10mMHCl浸泡2小時，用超純水清洗數次；吸附過濾：加硅藻土至消化液，混勻，靜置2小時；將濾紙置于過濾器中，把過濾器和循環衛生泵用硅膠管連接緊密，按過濾器和循環衛生泵的標準操作規程進行過濾，濾除硅藻土，得消化過濾液。

3.根據權利要求1所述的一種吸收率達到96%的納米級膠原蛋白提純方法，其特征在于：所述步驟5）提純過后需要進行干燥，且干燥的方法為為冷凍干燥，干燥時間為24-36小時。