[發明專利]一種糖肽或糖蛋白富集材料及其制備和應用

在審

• 申請號: 201710810842.7
• 申請日: 2017-09-11
• 公開（公告）號: CN109482150A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 張麗華;邵文亞;梁玉;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: B01J20/22
• 分類號: B01J20/22;B01J20/26;B01J20/28;B01J20/30;C07K1/14
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明屬糖肽/糖蛋白富集材料和分析技術領域，涉及一種基于酰肼策略的糖鏈可釋放糖基化肽段/蛋白富集材料及其制備方法和應用。通過化學反應在基質微球表面鍵合含有二硫鍵的酰肼化合物，形成表面具有酰肼基團的可用于糖肽富集的功能材料。本發明在材料表面通過引入二硫鍵而實現糖肽/糖蛋白的糖鏈可釋放的富集，與糖鏈之間采用共價結合的方式，具有富集效率高的優勢，而且克服了傳統酰肼法中糖鏈不易釋放，不能用于O?糖基化肽段/蛋白富集的缺點。本發明提供的糖鏈可釋放的富集材料易于制備，富集選擇性好，能廣泛適用于N?糖基化和O?糖基化肽段/蛋白的富集，在糖蛋白質組學等領域有很強的實用價值。

技術領域

本發明涉及一種基于酰肼策略的糖鏈可釋放糖基化肽段/糖蛋白富集材料及其制備方法，以及其在糖蛋白質組學中的應用。

背景技術

蛋白質的糖基化是生物體內最重要、最常見的翻譯后修飾之一，與細胞粘附、信號轉導、細胞凋亡、免疫應答等生物學過程及生理機能密切相關(Rudd,et al.Science 2001,291,2376-2378)。糖蛋白作為重要的生物標志物，目前已被廣泛應用于疾病的診斷、預警和藥效評價(Overath,et al.Mol.Cell.Proteomics 2012,11,467-477)。鑒于糖基化修飾在生命活動中的重要意義，糖基化蛋白質組學作為蛋白質組學的一個重要分支，也受到越來越廣泛的關注。但糖基化蛋白質組研究對象復雜：糖蛋白翻譯后修飾種類繁多、豐度低，質譜響應信號差。當前解決這一問題的重要途徑是發展新型功能材料以實現糖基化蛋白質高選擇性富集。

酰肼化學法是利用高碘酸氧化糖蛋白或糖肽糖鏈上的順式鄰二羥基后產生的醛基與含有酰肼基團的固相顆粒結合，從而實現對糖基化蛋白質/肽段的特異性富集。主要包括(1)氧化，糖鏈上的順式鄰二羥基在高碘酸鹽作用下被氧化生成醛基；(2)偶聯，生成的醛基與基質材料上的酰肼基團反應形成共價腙鍵，從而實現糖蛋白/糖肽的特異性捕獲；(3)洗脫，先洗脫掉體系中未發生共價結合的蛋白質或肽段，再經過糖苷酶處理釋放出糖基化的蛋白質或肽段進而進行下一步的質譜分析。酰肼化學法對糖鏈不存在歧視效應，共價結合的方式富集效率高，在高通量的糖基化位點尤其是N-型糖基化位點鑒定中，得到了很好的應用。但由于缺乏合適的糖苷酶，酰肼方法不適用于O-型糖基化位點的鑒定。

針對上述問題，我們設計了一種糖鏈可釋放糖基化肽段/蛋白富集材料。本發明提供的富集材料易于制備，富集選擇性好，能廣泛適用于N-糖基化和O-糖基化肽段/蛋白的富集，在糖蛋白質組學等領域有很強的實用價值。

發明內容

為了解決上述問題，本發明目的在于提供一種基于酰肼策略的糖鏈可釋放糖基化肽段/蛋白富集材料及其制備方法。該富集材料不僅可以實現廣泛的N-糖基化和O-糖基化肽段/蛋白的富集，而且制備方法簡單普適，容易實現。為了實現該目的，本發明的技術方案是：

1、巰基微球顆粒的制備：對于硅膠顆粒，加硅球于反應容器，分散于甲苯溶劑中，超聲分散均勻，加入硅烷化試劑，通氮氣0-50分鐘，機械攪拌，保持轉速300rad/min，加熱回流6-30小時，停止反應后，冷卻至室溫，使用高速離心機用2500～10000rad/min的速度離心3-5分鐘，棄上清液，固體顆粒依次使用甲苯、丙酮、甲醇抽濾洗滌，重復抽濾洗滌3-5遍，50℃真空干燥箱內真空干燥6-30小時，得到帶巰基的硅膠顆粒。

其中，硅烷化試劑為含有巰基的硅烷化試劑。硅膠顆粒占總質量的0.02～0.25wt％，單體的總摩爾數濃度為0.04～1mol/L，余量為反應溶劑。